田广，刘敏，苏艳丽
(1.贵航贵阳医院，贵州 贵阳 553009；2.贵阳护理职业学院，贵州 贵阳 550081)
天然维生素E又称生育酚、抗不育维生素或生殖维生素等，主要存在于植物油料、大豆、玉米胚芽、棉籽及葵花籽中[1]，具有抗衰老、抗肿瘤、预防及治疗心血管疾病的功效，还可调节血小板的黏附和凝集功能[2]，天然维生素E已被广泛地应用于食品、化妆品及医药制品[3]。苯并芘(Benzo(a)pyrene；3,4-Benzypyrene)是一种强致癌物质，在沥青、汽车尾气、烟熏及油炸食品中均含有不同程度的苯并芘[4]，一些原料植物在种植、晾晒、运输或生产加工过程中也可能会受到苯并芘的污染[5-6]。天然维生素E的生产主要以植物油高温生产脱臭过程的副产物-脱臭馏分作为原料[2]，苯并芘就不可避免地残留于脂溶性的维生素E产品中[7]。目前，苯并芘的测定方法有比色法、荧光光度法及液相色谱-荧光法等，其中液相色谱-荧光法因选择性好和灵敏度高的优点而被广泛应用[8]。由于天然维生素E基质的复杂性以及苯并芘的亲脂性[8-9]，常用的液液萃取、固相萃取及皂化除脂等方法很难将维生素E中的基质和维生素E选择性分离，对天然维生素E中的苯并芘测定均不很适用[10-11]。凝胶色谱(GPC)是基于溶质分子的流体力学体积大小进行分离的方法，能有效去除样品中的维生素E、植物油脂及天然色素等分子量较大的化合物[12-15]。本研究采用GPC对样品进行净化，考察GPC净化能力、优化GPC条件及建立凝胶色谱净化液相色谱-荧光法测定天然维生素E中苯并芘残留量含量，为天然维生素E的质量监控提供有效的技术手段。
1 材料与方法
1.1材料与设备
液相色谱仪(Ultimate 3000 型液相色谱仪)，配RFC3000荧光检测器(美国戴安公司)，凝胶净化色谱(美国)，AccuPrep GPC凝胶净化色谱[(美国J2 Scientific公司)，配200 mm×25 mm(i.d.)],净化柱(内装Bio-Beads，S-X3，38 μm～75 μm填料)，旋涡混匀器(XH-B,江苏康健医疗用品有限公司)，氮吹仪(美国，Organomation Associates 公司)，旋转蒸发仪(laborota 4011型，法国Heidolph公司)，环己烷、乙酸乙酯及乙腈(HPLC级，美国TEDIA公司)，苯并芘标准品购自德国Dr Ehrenstorfer公司。
1.2方法
1.2.1样品前处理 称取样品4.0 g(精确至0.000 1 g)于比色管(10 mL)中，加入乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1，V/V)溶解样品并定容至10 mL，混匀后过滤膜；取样品5.00 mL用GPC净化，以乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1，V/V)作流动相，流速4.7 mL/min，收集第17～25 min时的流出液。将流出液转移至100 mL旋蒸瓶中，40 ℃下旋蒸浓缩至干，用1.00 mL乙腈溶解残渣，过0.45 μm微孔滤膜后进行液相色谱测定。
1.2.2液相色谱条件 Agilent Zorbax XDB-C18液相色谱柱(150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm)，柱温35 ℃，进样量10 μL，流动相乙腈 ∶水(88 ∶12，V/V)，流速1.0 mL/min，常用C18柱为色谱柱，荧光检测器的激发波长为384 nm，发射波长为406 nm。
1.2.3GPC收集时间段的确定 用乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1，V/V)配制0.5 μg/L苯并芘标准溶液，取5.00 mL用GPC净化，从第10 min开始分段收集，测定回收率；以收集时间和回收率作淋洗曲线，确定收集时间段。
1.2.4GPC油脂净化能力的测试 分别称取1.0、2.0、4.0及6.0 g样品于于10 mL比色管中，加入乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1,V/V)溶解样品并定容至10 mL，混匀后过滤膜，取5.00 mL样品用GPC净化，收集第17～25 min时的洗脱液，浓缩后称量残渣重量，以残渣剩余量的多少作为GPC的净化能力。
2 结果
2.1GPC流动相的确定
考虑到使用流动相作为溶解样品的溶剂，故分别采用乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶13，V/V)、乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶2，V/V)、乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶31，V/V)对苯并芘进行溶解，结果发现随着乙酸乙酯比例的增加，苯并芘溶解性更好，故选择乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1，V/V)为流动相。
2.2GPC收集时间段的确定
GPC淋洗曲线见图1，实验结果显示苯并芘的流出时间段集中在18～24 min，为保证低含量水平的测定结果准确性，实验将GPC收集时间段定为17～25 min。
图1 GPC淋洗曲线
2.3GPC净化能力
GPC净化能力的测试结果如表1所示，实验结果显示，在第17～25 min时为收集时间段内，GPC能对2 g维生素E进行有效的净化。因此实验选择称取4.0 g样品，用乙酸乙酯 ∶环己烷(1 ∶1,V/V)稀释至10 mL，GPC进样5 mL。
2.4实验方法评价
2.4.1线性范围和定量限 本方法中获得了苯并芘浓度与相应色谱峰面积之间的良好的线性关系良好，相关系数均在0.999，线性范围为0.05～20 μg/L，相关系数均在0.999，检测限(S/N=3)为0.02 μg/kg，定量限(S/N = 10)为0.05 μg/kg。
表1 GPC油脂净化能力
2.4.2样品回收率及精密度 选择样品本底苯并芘含量<0.05 μg/kg的6个样本，以0.05、0.10、0.20及2.00 μg/kg浓度水平做添加回收实验，同时扣除本底值(0.034 5 μg/kg)，获得4个水平的平均回收率分别为98.0%、93.3%、96.4%及98.0%，相对标准偏差(RSD)分别为3.8%、2.6%、3.6%及2.1%，添加回收率数据详见表2。标准溶液、样品及样品添加标准溶液色谱结果如图2示。
表2 添加回收实验结果
注：A为标准溶液，B为样品，C为样品添加标准溶液。
3 讨论
目前，食品安全是一个世界性问题，由食品污染所导致的疾病已成为全世界最为广泛关注的卫生安全卫生问题之一[16-18]。苯并芘作为一种强致癌物质，它的危害也日益引起人们的重视关注，如何高效、快速的测定食品中的苯并芘含量具有重要意义[19-21]。而维生素E作为当今人们的日常保健品，其在生产过程中不可避免的会引入一定量的苯并芘，因此，如何从维生素E中快速，准确的鉴定其含量，事关食用者的健康[22-24]。然而，目前对其进行的研究鲜有报道，且已有方法检测限较低，操作繁琐[10-11]。为此，为了克服上述缺点，本研究采用GPC净化-高效液相联用技术来简化操作，提高检测限。实验用乙酸乙酯：环己烷(1 ∶1，V/V)直接对天然维生素E样品进行溶解，GPC净化，有效地去除了天然维生素E胶囊中的天然维生素E、植物油脂、明胶、甘油、天然色素等杂质，最大限度的保留的其中的并(a)芘，结合高效液相色谱-荧光检测测定植物油维生素E中的苯并(a)芘含量。本方法采用GPC净化有效地去除了天然维生素E胶囊中的天然维生素E、植物油脂、明胶、甘油、天然色素等杂质,使得本方法灵敏度大大提高、回收率好、重现性好及没有杂质干扰，提示可应用于天然维生素E中苯并(a)芘的检测。
综上所述，本研究成功建立成功建立天然维生素E中苯并芘残留量测定的GPC净化、高效液相色谱法，该法在0.1～20.0 μg/L的浓度范围内，色谱峰面积与其浓度之间线性关系良好，相关系数为0.999，检测限(S/N=3)为0.02 μg/kg，定量限(S/N=10)为0.05 μg/kg；具有操作简便、选择性好、灵敏度高及重复性好的优点。
