鳖甲-莪术药对对TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞侵袭转移能力及其上皮间质转化的作用及机制

朱久龙， 谢青， 黄雅珍， 朱曼荆， 骆小珊， 冯豆豆， 凌湘力， 谢苏***

(1.贵州医科大学 临床医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 中医科，贵州 贵阳 550004；3.宁波市北仑区人民医院 中医科，浙江 宁波 315000)

乳腺癌是严重危害我国女性健康的恶性肿瘤，在全国女性恶性肿瘤中发病率排名第一，死亡率排名第五[1]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)表达均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌的20%，由于其高侵袭性、高复发率以及极易发生远处转移等特点，成为乳腺癌防治的重点和难点[2]。目前TNBC的重要研究方向是针对手术及放化疗术后空窗期的有效药物。药对是中医临床遣药组方的常用配伍形式，经过配伍的药对可达到增强药效、减轻毒副作用的目的。早在《神农本草经》中就有“药有阴阳配合，子母兄弟”及“七情和合”等配伍理论记载。中药药对理论研究是现代中药有效组分研究中的重要一步，在药效物质和作用机理基本清楚的前提下，建立从有效方剂出发，在明确主靶点、强化主效应、降低副效应的基础上，寻求高效可控的现代中药，并建立以组分配伍研制现代中药的新模式，是中药现代化的重要研究方向[3]。基于此，有专家提出提出“养阴散结”理论[4-5]，临床选用鳖甲-莪术君药对组成中药复方，扶正与祛邪共用，滋阴与散结并举[6-7]，防治乳腺癌术后和(或)放化疗后复发转移[8]，使乳腺癌患者获得较好的生存质量及较长的生存周期[5]。课题前期研究发现，以鳖甲-莪术为君药对的甲术方能显着抑制乳腺癌模型小鼠的肿瘤生长，且和环磷酰胺联用能增强抗瘤作用，其可能机制与下调Wnt/β-Catenin信号通路中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc以及G1/S-特异性周期蛋白-D1(cyclin D1)蛋白表达有关[9]。为探讨鳖甲-莪术药对能否通过Wnt/β-catenin信号通路影响乳腺癌上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而影响乳腺癌细胞侵袭转移能力，本研究通过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导TNBC细胞MDA-MB-231，模仿增强其侵袭转移能力、促进其发生EMT进程的肿瘤生长环境，探究鳖甲-莪术药对对含药血清在抑制TGF-β1诱导的MDA-MB-231细胞侵袭转移能力及其抗EMT进程中是否优于单药使用，以及药对配伍规律及深层机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞株 人源性三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株，购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2实验动物 SPF级、6周龄、SD雌性、体质量(250±20)g的大鼠40只，购于长沙天勤生物科技有限公司，许可证号SCXK(湘)2019-0014。

1.1.3实验药品和试剂 鳖甲颗粒、莪术颗粒购自广东一方制药有限公司，紫杉醇购自美国MedChemExpress (MCE)公司(货号HY-B0015/CS-1145)。DMEM高糖培养基(美国Gibco公司，C11995500BT)、胎牛血清(以色列BI公司，04-001-ACS)、二甲基亚砜(DMSO，北京索莱宝科技有限公司，D8370)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA，美国Gibco公司，25200-056)、青、链霉素双抗(美国Hyclone公司，SV30010)、CCK8试剂盒(上海东仁化学科技有限公司，CK04)、高效RIPA裂解液组织/细胞(北京索莱宝科技有限公司，R0010)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，10494-1-AP)、抗波形蛋白(vimentin)抗体 (EPR3776，英国Abcam公司，ab92547)、E钙黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，20874-1-AP)、兔抗Wnt 3a多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，bs-22503R)、N钙黏蛋白(N-cadherin)兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，bs-22503R)、HRP标记山羊抗兔IgG二抗(武汉普美克生物公司，PMK-014-090)。

1.1.4实验仪器 SW-CJ-2FD 超净工作台(苏州净化设备有限公司)、Model 310恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)、CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)、Allegra 64R Centrifuge 台式高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)、多功能酶标仪(美国BioTek公司)、MinPROTEAN®Tetra电泳槽(美国BIO-RAD公司 )、MiniVE电泳仪(美国GE公司)、NanoDrop 2000C超微量分光光度计(美国Thermo公司)、ProFlexTM3 x 32孔逆转录PCR仪(美国Thermo公司)、ViiA7Dx荧光定量PCR仪(美国ABI公司 )、ChemiScope3000Mini化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1血清制备 40只SPF级雌性SD大鼠随机分成空白组、鳖甲组、莪术组、鳖甲-莪术组，共4组，每组10只。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”换算大鼠药量：大鼠每日给药剂量(g/kg)=成人每日用量(g/kg)×70(kg)×0.018(大鼠等效系数)/0.2(kg)×10。空白组予以蒸馏水灌胃10 mL/kg，每天2次，连续7 d；鳖甲组、莪术组、鳖甲-莪术组分别予以鳖甲(含生药量6 g/kg)、莪术(含生药量3 g/kg)、鳖甲-莪术药对(含生药量9 g/kg)灌胃10 mL/kg，每天2次，连续7 d。末次给药前，禁食不禁水12 h；末次给药后1.5 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，用一次性真空采血管采取心脏全血，静置、分离、过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.2.2细胞培养 将MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM混合培养基置于饱和湿度、5%CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养，隔日换液，当细胞生长到80%时进行消化传代，进行后续实验。

1.2.3含药血清分组 空白组，30%空白血清+DMEM高糖培养基；单诱导组，0.25%TGF-β1+30%空白血清+DMEM高糖培养基；鳖甲组，0.25%TGF-β1+30%鳖甲含药血清+DMEM高糖培养基；莪术组，0.25%TGF-β1+30%莪术含药血清+DMEM高糖培养基；鳖甲-莪术组，0.25%TGF-β1+30%鳖甲-莪术含药血清+DMEM高糖培养基；紫杉醇组，0.25%TGF-β1+30%空白血清+DMEM高糖培养基+紫杉醇(IC50浓度为890 nmol/L)。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖能力 将细胞以5× 103个/孔的密度接种于96孔培养板中，每组4个复孔。待24 h细胞贴壁后弃培养基，分别用各组含药血清培养基培养96 h，在相应时间点向96孔板中每孔加入CCK-8溶液10 μL和DMEM培养基90 μL，培养箱中孵育1 h后，采用多功能酶标仪在37 ℃、波长450 nm处测定各组吸光度(OD)值，细胞抑制率=(对照组-实验组)/(对照组-空白组)×100%。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移能力 将密度为1×106个/mL的细胞均匀铺板于6孔板内，待24 h细胞贴壁后弃培养基，用200 μL灭菌枪头划线，PBS缓冲液洗净划线上的残存细胞后加入各组含药血清培养基，使用电子显微镜分别于0、12及24 h拍照并观察细胞迁移能力的变化。

1.2.6Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 -80 ℃冰箱取出保存的基质胶，液化后与DMEM培养基按照1 ∶6比例稀释，于每个Transwell板上室加入50 μL，放入培养箱孵育4 h，待胶成为固态。按“1.2.4”方案干预细胞96 h后消化细胞并计数，用DMEM培养基配置成密度为1×104个/mL的细胞悬液，每个上室均匀加入200 μL，下室加入含10%胎牛血清的培养基800 μL/孔，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h。取出Transwell板，PBS缓冲液涮洗、晾干，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，PBS缓冲液再次涮洗、晾干，棉球擦去小室表面细胞和结晶紫，100倍倒置显微镜下观察各组细胞穿过小室情况，每孔随机取5个视野，统计细胞数目，计算平均值。

1.2.7Western blot法检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Wnt3a、β-catenin蛋白表达 按上述“1.2.4”方案干预细胞96 h后收集细胞，冰上裂解30 min，超声破碎仪破碎，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，将各组蛋白浓度调整为30 g/L，加入Loading Buffer ，100 ℃、10 min煮沸变性。10% SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转膜，5 %脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应一抗(稀释比1 ∶10 000至1 ∶800) 4 ℃孵育过夜，加入二抗(稀释1 ∶5 000)室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，ECL化学发光法曝光，条带保存，Image J软件分析条带灰度值，计算目标蛋白表达量。

1.2.8RT-qPCR检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Wnt3a及β-catenin mRNA表达 按上述“1.2.4”方案干预细胞96 h后收集细胞，Trizol法提取细胞总RNA，Nano-drop 2000c测定各组总RNA纯度和浓度，逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，逆转录反应条件为：25 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min。以cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行加样，样品在Applied Biosystems7500中进行RT-qPCR反应，引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成，引物序列见表1。反应程序：95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，循环40次；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。记录各组Ct值，mRNA以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.3 统计学分析

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果

2.1 TGF-β1诱导MDA-MB-231细胞EMT水平上调

细胞增殖抑制率结果表明，干预细胞24、48 h后，与空白组相比，单诱导组细胞增殖抑制率降低(P<0.05)。见图1A。24 h细胞迁移率结果表明，与空白组相比，单诱导组细胞迁移率增加(P<0.05)，见图1B。Transwell小室实验表明，干预细胞48 h后，与空白组相比，单诱导组细胞迁徙数目增多(P<0.05)，提示细胞侵袭能力增强。见图1C。Western blot实验表明，与空白组相比，单诱导组细胞E-cadherin蛋白表达下降，Vimentin、 N-cadherin蛋白表达上升(P<0.05)。见图1D-1E。综上结果，提示TGF-β1可增强MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭能力，促进其EMT进程。

2.2 含药血清对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响

干预细胞96 h后，与单诱导组比较，各含药血清组MDA-MB-231细胞的增殖抑制率均有不同程度的升高，表明各含药血清组均能抑制细胞增殖(P<0.05)。组间比较，紫杉醇组对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率最高，鳖甲-莪术组对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率高于鳖甲组和莪术组(P<0.05)，见图2。实验表明，鳖甲-莪术药对抑制 MDA-MB-231细胞增殖能力优于鳖甲、莪术单药使用。

注：A为MDA-MB-231细胞增殖抑制率结果，B为MDA-MB-231细胞迁移率结果，C为MDA-MB-231细胞侵袭数目，D为E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达，E为E-cadherin、Vimentin、N-cadherinm 蛋白表达统计结果；(1)与空白组比较，P<0.05。图1 空白组与单诱导组MDA-MB-231细胞侵袭转移能力Fig.1 Invasion and metastasis ability of MDA-MB-231 between blank group and single induction group

注：(1)与单诱导组比较，P<0.05；(2)与鳖甲-莪术组比较，P<0.05；(3)与紫杉醇组比较，P<0.05。图2 含药血清组对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率Fig.2 Proliferation inhibition rate of MDA-MB-231 cells in each experimental group

2.3 含药血清对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

与单诱导组相比，干预细胞24 h后，各含药血清组MDA-MB-231细胞迁移率均有不同程度的降低(P<0.05)，表明各含药血清组均能抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。组间比较，紫杉醇组MDA-MB-231细胞迁移率最低(P<0.05)，提示其抑制MDA-MB-231细胞迁移作用最佳；鳖甲-莪术组细胞迁移率低于鳖甲、莪术组(P<0.05)，表明鳖甲-莪术药对对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制效果优于鳖甲、莪术单用。见图3。实验表明，鳖甲-莪术药对抑制MDA-MB-231细胞迁移作用优于鳖甲、莪术单药使用。

2.4 含药血清对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

与单诱导组相比，各含药血清组的MDA-MB-231细胞迁徙数目均有不同程度的减少(P<0.05)，表明各含药血清组均能抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力。组间比较，紫杉醇组细胞迁徙数目最少(P<0.05)，提示其抑制细胞侵袭作用最佳；鳖甲-莪术组细胞迁徙数目少于鳖甲组、莪术组(P<0.05)，表明鳖甲-莪术药对对细胞侵袭能力的抑制效果优于鳖甲、莪术单用。见图4。实验表明，鳖甲-莪术药对抑制MDA-MB-231细胞侵袭作用优于鳖甲、莪术单药使用。

注：A为划痕实验结果，B为各组细胞迁移率；(1)与单诱导组比较，P<0.05；(2)与鳖甲-莪术组比较，P<0.05；(3)与紫杉醇组比较，P<0.05。图3 各含药血清组对 MDA-MB-231细胞迁移能力的影响Fig.3 Effect of each experimental group on the migration ability of MDA-MB-231 cells

注：A为侵袭实验结果，B为侵袭细胞数目；(1)与单诱导组比较，P<0.05；(2)与鳖甲-莪术组比较，P<0.05；(3)与紫杉醇组比较，P<0.05。图4 各含药血清组对 MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of each experimental group on the invasive ability of MDA-MB-231 cells

2.5 含药血清对EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达的影响

Western blot实验表明，与单诱导组比较，各含药血清组均能上调E-cadherin蛋白表达，下调Vimentin、N-cadherin蛋白表达(P<0.05)。组间比较，鳖甲-莪术组E-cadherin蛋白表达最高；Vimentin、N-cadherin蛋白表达，紫杉醇组表达最低，鳖甲-莪术组表达低于鳖甲组、莪术组(P<0.05)。见图5A、图5C。

2.6 各含药血清组对Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响

Western blot实验表明，与单诱导组比较，各含药血清组均能下调Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平(P<0.05)。组间比较，紫杉醇组Wnt3a、β-catenin蛋白表达最低，鳖甲-莪术组Wnt3a、β-catenin蛋白表达低于鳖甲组、莪术组(P<0.05)。见图5B、图5D。

注：A为EMT相关蛋白图，B为Wnt通路相关蛋白图，C为EMT相关蛋白表达量，D为通路相关蛋白表达量；(1)与单诱导组比较，P<0.05；(2)与鳖甲-莪术组比较，P<0.05；(3)与紫杉醇组比较，P<0.05。图5 含药血清对MDA-MB-231细胞中EMT及Wnt通路中相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of drug containing serum on EMT and Wnt signaling pathway-related protein expression in MDA-MB-231 cells

2.7 含药血清对EMT相关E-cadherin、Vimentin、N-cadherin mRNA表达的影响

RT-qPCR实验表明，与单诱导组比较，各含药血清组均能上调MDA-MB-231细胞中E-cadherin、下调Vimentin、N-cadherinmRNA表达水平(P<0.05)。组间比较，鳖甲-莪术组E-cadherinmRNA表达最高；Vimentin、N-cadherinmRNA表达方面，紫杉醇组最低，鳖甲-莪术组表达低于鳖甲组、莪术组(P<0.05)。见图6A。

2.8 含药血清对Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3a、β-catenin mRNA表达的影响

RT-qPCR实验表明，与单诱导组比较，各含药血清均能下调MDA-MB-231细胞中Wnt3a、β-cateninmRNA表达水平(P<0.05)。组间比较，紫杉醇组Wnt3amRNA表达最低，鳖甲-莪术组β-cateninmRNA表达最低，鳖甲-莪术组表达低于鳖甲组、莪术组(P<0.05)。见图6B。

注：A为EMT相关mRNA表达量，B为Wnt通路相关mRNA表达量；(1)与单诱导组比较，P<0.05；(2)与鳖甲-莪术组比较，P<0.05；(3)与紫杉醇组比较，P<0.05。图6 含药血清对MDA-MB-231细胞中EMT和Wnt通路中相关mRNA表达的影响Fig.6 Effect of drug containing serum on EMT and Wnt signaling pathway-related mRNA expression in MDA-MB-231 cells

3 讨论

乳腺癌属于中医学“乳岩”“石岩”等范畴，古今医家在治疗上多有各自的心得和见解。有学者认为，在肿瘤发病上，正气不足是关键因素，痰、瘀、湿、郁、热毒是其病理基础，女性乳腺癌亦是如此；乳腺癌病机实质是“阴中之阳”，“阳胜则阴病”，其亢烈之性必灼伤真阴，且“女子以肝为先天，以阴血为本”，术后女性病人正气大伤，阴阳俱虚，加之放化疗的不良反应，导致阴阳失衡，严重耗伤真阴；此时患者余邪未清，正气亦无力鼓邪外出，痰、湿、瘀、热、郁夹杂结聚，以致生活质量不佳，预后不良；基于真阴不足、瘀毒结聚的乳腺癌病机，提出了“养阴散结”的理论[10]。临床中多选用以鳖甲-莪术为君药对组方治疗肿瘤[11]，鳖甲味甘、咸、性寒，入肝肾经，大补真阴，软坚散结，滋阴潜阳，除骨蒸，退虚热；莪术味辛、苦、性温，入肝脾经，苦泄辛散温通, 即入血分, 又入气分, 能破血散瘀, 消症化积, 行气止痛。二者配伍，“阴阳双消，滋阴起亟”[16]，既能滋阴潜阳，辅助正气，又能增强软坚散结, 破血化瘀消症之力，消补结合，攻补兼施，达到扶正不留邪、祛邪不伤正的目的。

EMT是三阴性乳腺癌扩散转移的重要途径[12]。EMT是指上皮细胞失去黏附特性，从而获得间质细胞特性，极性和细胞连接丧失，从而获得运动和迁移能力[13]，使细胞从原发灶脱离并向基质浸润，通过血道或淋巴道向远处转移的过程[14]。临床通过对乳腺癌细胞和乳腺癌组织的分析，发现三阴性乳腺癌中普遍存在Vimentin、N-cadherin高表达，以及E-cadherin低表达[15]。研究表明，抑制EMT可有效降低TNBC复发转移的风险[16]。TGF-β1可促进乳腺癌EMT进程[17]。在体内，TGF-β1可刺激上皮细胞的EMT，促进EMT的进展[18]。在肿瘤细胞生长早期，TGF-β1的主要作用是通过抑制细胞周期G1的进展来控制肿瘤细胞增殖[19],而当肿瘤细胞进入不可控生长阶段时，会对这种抑制效应失去敏感性[20]，此外，这些肿瘤细胞开始分泌TGF-β1，并促进血管生成、增加肿瘤细胞稳定性，并创造出一个有利于肿瘤生长和转移的微环境，提高肿瘤细胞的侵袭性[21]。研究表明，淋巴结转移的乳腺癌患者TGF-β1表达水平明显高于无淋巴结转移者，在TGF-β1诱导条件培养基中培养的肿瘤细胞表现出更高的增殖和运动能力[22]。Wnt/β-catenin信号通路可介导乳腺癌发生EMT[23]。当Wnt信号激活通路后，β-catenin进入细胞核与转录因子形成转录复合物，引起下游靶基因的转录[24]。β-catenin向细胞核内聚集引起E-cadherin失去cadherin-catenin锚定连接而破坏E-cadherin/β-catenin复合体的稳定性[25]，E-cadherin失去黏附功能，导致细胞分散，移动力增加，获得侵袭性间质表型，促进EMT进程[26]。研究表明，β-catenin与乳腺癌的侵袭迁移密切相关，侵袭型乳腺癌较非侵袭型相比β-catenin表达明显增加，通过激活Wnt/β-catenin信号通路可降低E-cadherin表达[27]。因此，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活是影响EMT进程的重要途径。

紫杉醇具有明确的细胞抑制作用，能够阻滞细胞有丝分裂，并能通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路抗乳腺癌细胞侵袭转移[28]。紫杉醇组作为阳性对照组，可增加实验的科学性和可信度。选择半数抑制浓度(IC50)作为干预浓度，是因为小剂量紫杉醇具有促进乳腺癌细胞增殖的作用[29]，而半数抑制浓度的抑制率就是50%，可以排除紫杉醇浓度干扰所致的实验结果错误。本研究中，TGF-β1促进了MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭转移能力及EMT进程。各含药血清组均能抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力，上调E-cadherin，下调Vimentin、N-cadherin、Wnt3a、β-catenin蛋白及mRNA表达，且鳖甲-莪术药对联用具有增强药效的作用，效果均优于鳖甲、莪术单药使用。鳖甲-莪术药对可能是通过下调Wnt3a、β-catenin，从而减少Wnt/β-catenin通路中关键的信号介质，进而影响乳腺癌细胞的EMT进程及其侵袭转移能力。

综上，根据中医“养阴散结”理论，鳖甲-莪术药对经过配伍后药效增强，其效果优于单药使用，其对TGF-β1诱导MDA-MB-231细胞侵袭转移能力的抑制作用，可能机制为下调Wnt/β-catenin信号通路、抑制其EMT。