孙亦鹏 史兆雯 倪振华 缪夏轶 林玉华 毕俊杰 王雄彪
支气管哮喘是我国的常见病，发病率约为1%,且呈逐年上升趋势，其死亡率居高不下，已成为社会卫生经济的沉重负担[1]。黏蛋白(mucin,MUC)5AC是人气道黏液中的重要蛋白质，生理状态下呈低表达。哮喘患者可分泌大量含MUC5AC的黏液，损害气道纤毛的清除功能，累积形成黏液栓堵塞气道，致使患者发生喘息、呼吸困难，甚至窒息[2]。2019年一项全基因组关联分析研究[3]结果显示，MUC5AC基因的rs11603634位点与中重度哮喘的发生密切相关，且重度哮喘患者的支气管上皮细胞中MUC5AC mRNA水平显着升高。MUC5AC不仅是黏液的组成部分，亦是产生气道高反应的必要条件，降低机体MUC5AC水平可显着抑制气道高反应性[4]。因此，MUC5AC有望成为治疗哮喘的潜在靶点。
苯并芘[benzo(a)pyrene, BaP]是多环芳烃类的化学空气污染物[5]。有研究[6]结果表明，BaP与哮喘发病有关，能加重哮喘患者的临床症状。BaP可显着提高MUC5AC蛋白质或基因的表达水平，其机制可能是BaP激活芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)，提高细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，进而上调MUC5AC的表达[7-8]。目前尚无有效药物可抑制BaP诱导的MUC5AC表达[9]。
中医药物在哮喘治疗方面具有独特的优势。芪仙汤是本课题组根据临床经验总结的自拟药方，由黄芪30 g、仙灵脾30 g、巴戟天30 g、虎杖30 g、川芎15 g、旋覆花9 g、枇杷叶30 g、生地30 g组成，具有化瘀祛痰、补肺益肾的功效。既往研究[10-13]发现，芪仙汤可改善卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏小鼠的气道炎症细胞浸润、杯状细胞增生情况，降低外周血免疫球蛋白(Ig)E和辅助性T淋巴细胞亚群2(Th2)分泌的细胞因子水平，抑制气道上皮间质转化。本研究通过应用芪仙汤干预BaP诱导人支气管黏液上皮样细胞NCI-H292细胞株，制造MUC5AC高表达的细胞模型，观察该提取物对MUC5AC表达的影响， 并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞与试剂 NCI-H292细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生物研究所。RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，Cell Counting Kit(CCK)-8试剂盒购自日本同仁化学公司，BaP购自美国Sigma公司，蛋白裂解液购自上海碧云天公司，ROS/Superoxide试剂盒购自美国Abcam公司。MUC5AC、β-肌动蛋白(actin)抗体购自美国Abcam公司，细胞外信号调节激酶(ERK)1/2 、磷酸化ERK(p-ERK)1/2、相对分子质量为90 000的核糖体S6激酶(RSK)、磷酸化p90(p-p90) RSK抗体，以及羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自美国CST公司。细胞色素P450(CYP)1A1购自美国Protein Tech公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、1.0 g/mL链霉素的RPMI-1640培养基培养的NCI-H292细胞株置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中，隔天换液。
1.2.2 实验分组 ①检测细胞增殖活性实验，以不同质量浓度(0、60、120、240、480、960 μg/mL)的芪仙汤提取物处理细胞48 h，分为6组。②其他实验均将细胞分为4组：空白组(以二甲基亚砜处理)、模型组(以BaP 10 μmol/L处理)、芪仙汤低浓度组(以BaP 10 μmol/L处理+芪仙汤提取物240 μg/mL处理)和芪仙汤高浓度组(以BaP 10 μmol/L+芪仙汤提取物 480 μg/mL处理)。检测MUC5AC蛋白质和mRNA水平时，BaP与芪仙汤提取物同时处理细胞48 h；检测ROS活性、ERK通路蛋白质和CYP1A1蛋白质水平时，BaP与芪仙汤提取物同时处理细胞24 h。其中， AhR激活后可促进CYP1A1基因转录，因此CYP1A1水平升高可作为AhR激活的标志[14]。
1.2.3 芪仙汤提取物制备 采用芪仙汤水提物，具体制备方法见参考文献[13] 。
1.2.4 细胞增殖活性检测 收集NCI-H292细胞株，以每孔7×103个细胞密度接种于96孔板。细胞培养过夜后，分别加入不同质量浓度的芪仙汤提取物处理细胞48 h，弃上清液，每孔加入CCK-8溶液100 μL，继续培养2 h，使用酶标仪测定波长为450 nm处各孔细胞的吸光度值。
1.2.5 细胞内ROS水平检测 收集NCI-H292细胞株，以每孔1×104个细胞密度接种于96孔板。细胞贴壁过夜后，分别加入药物处理24 h。弃上清液，以无血清培养基将5 mmol/L的氧化应激探针以1∶1 000稀释倍数加入孔内，于37 ℃避光孵育30 min，以1×PBS洗3遍，置于荧光显微镜下观察并拍摄各组细胞状态，应用Image pro plus 6.0软件将荧光强度转换为吸光度值，进行统计学分析。
1.2.6 实时荧光定量PCR 采用TRIzol提取细胞总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)说明书将样品反转录成cDNA，应用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒检测MUC5AC、CYP1A1 mRNA水平，反应条件：94 ℃ 10 min, 94 ℃ 30 s ，60 ℃ 1 min，共40个循环。以β-actin基因作为内参，ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值)，采用 2-ΔΔCt法计算目的基因 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.2.7 免疫印迹实验 取等量蛋白质样本行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将其转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以TBST缓冲液+5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭2 h。将膜分别与相应一抗置于4 ℃孵育过夜，以TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔或抗鼠IgG二抗，置于室温孵育2 h。再以TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL发光液，应用Bio-Rad化学发光成像系统曝光显影，以Image J软件计算各组目的蛋白质灰度值。
2 结 果
2.1 芪仙汤提取物对NCI-H292细胞株活力的影响 经60、120、240、480 μg/mL的芪仙汤提取物处理后的NCI-H292细胞株存活率分别为(100.57±0.10)%、(100.40±0.03)%、(101.63±0.07)%、(96.20±0.06)%，与0 μg/mL的芪仙汤提取物处理后的(99.70±0.05)%比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。经960 μg/mL的芪仙汤提取物处理后的NCI-H292细胞株存活率为(45.95±0.04)%，显着低于0 μg/mL的芪仙汤提取物处理组(P<0.05)。综合考量，本研究选用240、480 μg/mL分别作为芪仙汤提取物的低、高浓度。
2.2 芪仙汤提取物对BaP诱导MUC5AC蛋白质及其mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组MUC5AC蛋白质和mRNA水平均显着升高(P值均<0.01)。与模型组比较，芪仙汤低、高浓度组的MUC5AC蛋白质和mRNA水平均显着降低(P<0.05或0.01)。见图1和表2。
1 空白组 2 模型组 3 芪仙汤低浓度组 4 芪仙汤高浓度组图1 芪仙汤提取物对BaP诱导的MUC5AC蛋白质表达的影响
表2 4组MUC5AC蛋白质和mRNA相对表达量的比较
2.3 芪仙汤提取物对BaP诱导氧化应激水平的影响 模型组细胞株ROS荧光强度值为2 296.67±310.16，显着高于空白组的105.00±14.52(P<0.01)；芪仙汤低、高浓度组细胞株ROS荧光强度值分别为(1 576.00±339.26)、(762.00±209.52)，均显着低于模型组(P<0.05或0.01)。见图2。
A 空白组 B 模型组 C 芪仙汤低浓度组 D 芪仙汤高浓度组图2 4组细胞ROS荧光强度
2.4 芪仙汤提取物对AhR活化的影响 与空白组比较，模型组的CYP1A1蛋白质和mRNA水平均显着升高(P值均<0.01)。与模型组比较，芪仙汤高浓度组CYP1A1蛋白质水平显着降低(P<0.01)，芪仙汤低、高浓度组的CYP1A1 mRNA水平均显着降低(P值均<0.01)。见图3和表3。
1 空白组 2 模型组 3 芪仙汤低浓度组 4 芪仙汤高浓度组图3 芪仙汤提取物对BaP诱导的CYP1A1蛋白质表达的影响
表3 4组CYP1A1蛋白质和mRNA相对表达量的比较
2.5 芪仙汤提取物对ERK通路的影响 p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白质表达水平升高是ERK通路被激活的重要标志。与空白组比较，模型组p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白质水平均显着升高(P值均<0.01)。与模型组相比，芪仙汤低、高浓度组的p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白质水平均显着降低(P值均<0.01)。见图4和表4。
1 空白组 2 模型组 3 芪仙汤低浓度组 4 芪仙汤高浓度组图4 各组p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白质相对表达量的比较
表4 4组p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白质相对表达量的比较
3 讨 论
气道黏液是呼吸系统黏膜屏障的重要组成部分。黏液主要由水、脂质、糖蛋白和无机盐组成，MUC是糖蛋白的最主要成分，对于维持黏液的黏稠度和纤毛清除功能具有重要作用。MUC是由杯状细胞等分泌的一种高度糖基化的蛋白质，是黏液中主要的大分子物质[15]。目前已发现约20种MUC基因，可分为膜结合型MUC基因和分泌型MUC基因，分泌型MUC基因又分为聚合型和非聚合型。聚合型MUC基因编码的蛋白质具有复杂、多种结构域等特点，使其能够聚合MUC，形成凝胶[16]。研究者聚焦的MUC5AC即分泌型聚合MUC。
MUC5AC表达异常是哮喘发病的重要机制之一。MUC5AC高表达可导致黏液分泌增多，阻塞气管管腔，导致气流受阻。哮喘患者大量分泌MUC5AC高表达的黏稠黏液，黏液不易排出，加重病情[17]。在OVA致敏小鼠的肺组织中发现，MUC5AC蛋白质高表达，黏液阻塞气道，而敲除MUC5AC基因的OVA致敏小鼠的气道黏液阻塞比例降低了74%[4]，药物干预也可达到类似的效果[18]；MUC5AC的高表达还可导致哮喘患者的气道高反应。敲除MUC5AC基因的OVA致敏小鼠对乙酰甲胆碱的反应性显着降低，表明敲除MUC5AC可消除OVA引起的气道高反应[4]。因此，抑制MUC5AC蛋白质的表达可改善哮喘患者的病情。
在哮喘发病过程中，多种外界刺激因素(如空气污染物等)会诱导MUC5AC基因高表达[19-20]。本研究发现，BaP刺激可以显着诱导MUC5AC表达，由于BaP是PM2.5的重要组成部分，可解释PM2.5能诱导MUC5AC高表达的原因[20]。本研究也发现，AhR介导的ROS和ERK激活在BaP诱导的MUC5AC水平升高中起到重要作用，BaP激活AhR后可使细胞内ROS水平升高，诱导EKR信号通路活化，从而促进MUC5AC蛋白质表达；芪仙汤提取物可抑制AhR活化，进一步抑制ROS和ERK的激活。芪仙汤复方的有效成分可以通过多靶点调节AhR的表达和活性变化，如Chi等[21]发现淫羊藿的单体之一淫羊藿苷可抑制AhR基因的表达，Ciolino等[22]则发现虎杖的单体之一白藜芦醇可与AhR核转位因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)形成复合物从而抑制AhR入核。因此，笔者认为芪仙汤提取物主要通过其有效成分(白藜芦醇或淫羊藿苷等)从多靶点抑制AhR的活化，从而削弱BaP对MUC5AC表达的诱导。但该结论尚需进一步研究证实。
综上所述，本研究发现芪仙汤可下调BaP诱导的人气道上皮细胞中MUC5AC基因和蛋白质的高表达，其机制可能是抑制了AhR介导的ROS和 ERK通路的活化，相关研究结果为缓解PM2.5相关的哮喘病症提供了可行的理论基础。
