王 琳，马晓娟 ，孙明月 ，苗 洋，殷惠军，
1.甘肃中医药大学(兰州 730000)； 2.中国中医科学院西苑医院
丹参瓜蒌配伍对高脂血症小鼠铁调素及相关信号通路的影响
王琳1，马晓娟2，孙明月2，苗洋2，殷惠军1，2
1.甘肃中医药大学(兰州 730000)； 2.中国中医科学院西苑医院
摘要：目的观察丹参、瓜蒌配伍对高脂血症小鼠及相关BMP/SMAD信号通路的影响，探讨其可能的调脂机制。方法50只雄性Fpn1Tek-cre小鼠随机分为正常对照组、模型组、阿托伐他汀组、丹参组、瓜蒌组、丹参瓜蒌组，每组8只。高脂高胆固醇饲料喂养8周复制高脂血症模型。8周后，继续高脂喂养并按体重比折算的临床推荐剂量分别给予生理盐水、阿托伐他汀混悬液5.1 mg/kg、丹参组2.56 g/kg、瓜蒌组3.84 g/kg、丹参瓜蒌组6.4 g/kg。连续灌胃2周后，分离血清及肝组织。生化检测：TC、TG、LDL-C、HDL-C ；酶联免疫吸附法测：血清铁调素、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)；免疫组化法测肝组织骨形态发生蛋白(BMP6)表达量；Western blotting检测肝组织p-smad1/5/8，p-stat3蛋白表达。结果与空白组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C、铁调素(hepcidin)含量明显升高(P<0.05)，提示造模成功。与模型组比较，各用药组小鼠血清铁调素含量有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)；BMP6蛋白表达亦有所下降(P<0.05)。与阿托伐他汀组比较，丹参瓜蒌组stat、smad蛋白磷酸化表达显着下降(P<0.05)。与丹参组比较，丹参瓜蒌组明显降低TC、hepcidin水平(P<0.05)；与瓜蒌组比较，丹参瓜蒌组能显着降低TG、TC、铁调素水平(P<0.05)。结论丹参、瓜蒌配伍通过调节小鼠铁调素降脂，其调脂机制为调节BMP/SMAD信号通路抑制铁调素表达。丹参瓜蒌配伍效果优于两药单独使用，为临床治疗痰浊血瘀型高脂血症提供了理论支持。
关键词：高脂血症；铁调素；丹参；瓜蒌；BMP/SMAD信号通路；小鼠
自1981年Sullivan提出“铁假说”，绝经前女性患病率明显低于男性，绝经后女性冠心病的发生率及病死率与男性相差无几。绝经前与绝经后女性心血管疾病发生风险增加2倍，推断绝经前低发病率与周期性经血使血清铁降低相关，低血清铁水平对心脑血管有保护作用[1-2]。肝组织分泌的铁调素(hepcidin)是调节机体铁吸收、转运、释放、分布的抗菌多肽，其受体ferroportin是目前已知的小肠上皮和巨噬细胞铁唯一排除途径。高脂血症在中医多属“痰浊”“头晕”等症，治当以活血化瘀、化痰祛浊，丹参活血通经，瓜蒌利气宽胸，配伍合奏活血化痰，药理学实验研究表明两药均有明显调脂功效。本课题组将二药配伍以期为活血化痰治疗高脂血症提供支持。前期研究支持铁调素表达与内皮损伤间相关性[3]。内皮细胞膜转铁蛋白表达较低，故拟用fpn1内皮基因敲除(fpn1 tek-cre)小鼠加重铁沉积，探讨丹参、瓜蒌对高脂损伤血管内皮的保护作用是否通过参与BMP/smad信号通路调节铁调素表达及其相关机制，为防治高脂血症组方配伍基础药物提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物50只8周龄雄性fpn1 tek-cre小鼠，与C57BL/6J小鼠同遗传背景，清洁级(28±2)g，由上海实验动物科技有限公司提供，动物饲养期间自由饮水、摄食，室温(22±3)℃，湿度(50±20)%，光照时间07：00～19：00。
1.1.2药物丹参(Salvia miltiorrhiza，SM)，产品批号：1404011，产地：山东；瓜蒌(Trichosanthes Kirilowii Maxim，TKM)，产品批号：1408031，产地：河北；药品生产许可证号：冀Y20100008 河北神农(北京)药业有限公司；阿托伐他汀钙片(阿乐)10 mg/片生产批号121216，国药准字H19990258北京嘉林药业股份有限公司；基础饲料，由北京科澳协力饲料有限公司提供，高脂饲料(2%胆固醇，0.5%胆酸盐，10%猪油，10%蛋黄粉，5%糖，72.5%基础饲料)由北京诺康源生物技术有限公司加工定制，生产许可证：(2008)08122。中药水煎剂，煎药时，加水浸泡30 min，头煎加总药量10倍的水，二煎加总药量5倍的水，弃渣取汁，合并2次药汁，浓煎至生药量1 g/mL。密封于无菌瓶中，4℃存储备用。阿托伐他汀混悬液由阿托伐他汀钙片研磨成细粉，与生理盐水混合而成，现用现配。
1.1.3仪器全自动生化分析仪CS-T300迪瑞(中国吉林长春)，Miller-Q超纯水/Elix纯水系统(美国MILLIPORE公司)，SARTORIUS电子天平(德国)，THERMO Scientific酶标仪(美国)，SIGMA低温高速离心机(德国)，水浴箱(上海仪器制造厂)， OLYMPUS显微镜(日本)，SANYO-80℃超低温冰箱(日本)，制冰机。
1.1.4实验试剂及耗材胆固醇(TC)，胆固醇氧化酶法，产品批号：ZL3103AA22)；甘油三酯(TG)，甘油磷酸氧化酶法产品批号：ZL3103AA21)；高密度脂蛋白(HDL)直接法产品批号：ZL3102AA21)；低密度脂蛋白(LDL)直接法产品批号：ZL3101AA22)。全自动生化分析所用试剂均购自北京万泰德瑞诊断技术有限公司。Hepcidin试剂盒BlueGene(E03H0051)；MDA试剂盒、SOD试剂盒(LS-E12041 、LS-E12040)；IL-6试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司(货号：EMC004)。酶联免疫吸附实验严格按照试剂盒说明书进行检测和计算。Anti-BMP6 抗体(批号：GR116943-10购自abcam公司)； p-Smad1/5/8抗体(批号：G1614)，p-Stat3 抗体(批号：A1911)均购于santa公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1分组及给药50只雄性Fpn1 Tek-cre小鼠按体重随机法分为正常对照组和造模组，其中8只普通饲料喂养为正常对照组(normal group，NOR)，42只高脂高胆固醇饲料连续喂养8周复制高脂血症，8周后，随机抽取2只小鼠全自动生化分析仪检测血脂水平升高，确认造模成功后再随机分为模型组(model group，MOD)、阿托伐他汀(Atorvastatin，group ATO降脂阳性对照组)、丹参(Salvia miltiorrhiza group，SM)组、瓜蒌组(Trichosanthes Kirilowii Maxim group，TKM)组、丹参瓜蒌组(SM-TKM)，各8只。继续高脂喂养并按体重比折算的临床推荐剂量分别给予生理盐水、ATO混悬液5.1 mg/kg、SM组 2.56 g/kg、TKM组 3.84 g/kg、SM-TKM组 6.4 g/kg 连续灌胃2周。
1.2.2样本采集及处理术前12 h禁食不禁水，7%水合氯醛4 mL/kg麻醉，摘取眼眶静脉丛采血，收集血液，脱颈处死，静置30 min，3 000 r/min离心15 min，取上层血清储存-80℃冰箱待测。同时摘取肝组织，在预冷生理盐水中洗净血液，将同一部位完整肝右叶4%多聚甲醛固定，剩余肝组织放置冻存管中迅速液氮冷冻，待检。
1.2.3检测指标血脂TC、TG、HDL-C、LDL-C检测参照文献[4]。
1.2.4ELISA法测定血清hepcidin、MDA含量、SOD活性及IL-6含量每组随机选7只动物血清，采用酶联免疫吸附法测。严格按照试剂盒说明书进行检测和计算。设浓度值为横坐标，测得各标准孔OD值为纵坐标，采用Curve Expert1.38软件绘制标准曲线。按样本孔测得的吸光度值从标准曲线上查得相应的浓度值。双抗夹心法测血清中hepcidin、IL-6含量，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。
1.2.5免疫组化检测肝组织BMP6蛋白表达4%甲醛固定48 h的肝组织，石蜡包埋；5 μm连续切片；脱蜡、脱水；抗原热修复90 s暴露抗原；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，山羊血清封闭非特异性抗原10 min后，加兔抗BMP6单克隆抗体(稀释度为1∶200)，4℃孵育过夜，阴性对照用PBS代替一抗。PBS洗涤后加生物素标记的山羊抗兔IgG，滴加辣根过氧化物标记的链霉卵白素，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，显微镜下观察并照相。BMP6阳性产物主要分布在正常肝组织膜上，为粗细一致的棕黄色颗粒。肝高倍镜(×400)下每张切片分别选取左上、左下、右上、右下和正下5个视野，使用Image Pro plus6.0软件对阳性区域累积积分光密度进行定量测定，最后求取各指标阳性区域面积占总面积的百分比。
1.2.6Western blotting检测肝组织p-smad1/5/8，p-stat3蛋白表达将肝组织从液氮中取出，放入预冷的研钵中加入液氮快速研磨，经Bradford法测定蛋白含量后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗p-smad1/5/8，p-stat3均为1∶1 000稀释，4℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃震荡60 min，ECL化学发光试剂盒显色，X光片显影，用AlphaEaseFC1软件对扫描的目的条带图像进行灰度分析。每组实验重复4次。
2结果
2.1各组小鼠血脂变化(见表1)与正常对照组比较，模型组血清TG 、TC、 LDL-C水平显着提高(P<0.05)，HDL-C明显下降(P<0.05)；与模型组比较，各用药组小鼠血清TG 、TC、 LDL-C水平均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，HDL-C 水平有所升高(P<0.05)，其中以丹参瓜蒌组对TC影响最显着(P<0.01)。与丹参组比较，丹参瓜蒌组对TC、TG水平下降差异有统计学意义(P<0.05)。与瓜蒌组比较，丹参瓜蒌组降低TC、TG差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表1 各组小鼠血脂水平变化(±s) mmol/L
2.2各组小鼠血清SOD活性、MDA含量的变化及Hepcidin、IL-6含量(见表2)与正常对照组比较，模型组血清MDA、hepcidin、IL-6含量明显增多(P<0.05)，SOD活性明显下降(P<0.05)；与模型组比较，各用药组血清MDA、hepcidin、IL-6含量均有不同程度下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与阿托伐他汀组比较，丹参瓜蒌组降低hepcidin水平具有明显统计学意义(P<0.05)。与丹参组比较，丹参瓜蒌组降低血清hepcidin、IL-6含量显着(P<0.05)。与瓜蒌组比较，丹参组、丹参瓜蒌组降低IL-6差异有统计学意义(P<0.05)
表2 各组小鼠血清氧化水平、铁调素、炎症因子变化(±s)
2.3各组小鼠肝组织内BMP6蛋白表达的图像分析及平均光密度比较(×400)根据BMP6蛋白表达平均光密度值分析：与正常组比较，模型组BMP6蛋白表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各用药组BMP6蛋白表达均有不同程度减少(P<0.05或P<0.01)。与阿托伐他汀组比较，丹参瓜蒌组差异有统计学意义(P<0.05)；与丹参组比较，丹参瓜蒌组BMP6蛋白表达减少显着(P<0.05)。与瓜蒌组比较，丹参瓜蒌组BMP6蛋白表达减少(P<0.05)。详见表3、图1。
表3 免疫组化检测小鼠肝组织BMP6平均光密度比值(±s，n=3)
注：A为NOR组；B为MOD组；C为ATO组；D为SM组；E为TKM组；F为SM-TKM组。
2.4各组小鼠内皮细胞内smad1/5/8、stat3蛋白磷酸化水平的影响凝胶图像分析结果所示，与正常组比，模型组小鼠内皮细胞内smad1/5/8、stat3蛋白磷酸化表达明显增多(P<0.05)，与模型组比较，丹参组、瓜蒌组、丹参瓜蒌组使smad1/5/8、stat3蛋白表达量不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，其中以丹参瓜蒌组对smad1/5/8、stat3蛋白磷酸化表达下降最明显。详见图2、表4。
注：A为NOR组；B为MOD组；C为ATO组；D为SM组；
E为TKM组；F为SM-TKM组。
图2 各组小鼠肝组织磷酸化Smad1/5/8、
3讨论
铁是维持生命健康必需的微量元素，常以结合铁和游离铁(Fe2+和Fe3+)形式存在且相互转换；在细胞氧运输、细胞呼吸、能量代谢、基因表达、DNA复制和修复等过程中重要的电子传递体[5]。过多的铁离子通过Fenton反应和Haber-Weiss循环产生自由基[6]，这些产物堆积加速体内脂质氧化，尤其是LDL氧化成为具有毒性的ox-LDL沉积并损伤内皮。铁调素是调节机体铁吸收、转运、释放、分布的抗菌多肽，血清中的hepcidin能够与细胞膜表面受体fpn结合并使其内化降解，阻滞组织细胞内铁转运到细胞外[7]。hepcidin-fpn1调控通路是目前已知对铁代谢调节唯一排除途径。同时，通过这一通路抑制小肠铁吸收和巨噬细胞铁释放及减少肝组织储存铁。铁调素降解细胞膜上fpn1增加细胞内铁离子[8]。据此推断小鼠fpn1基因敲除会使机体出现组织铁蓄积，细胞内铁排出障碍。然而铁蓄积对机体的影响说法不一[9]，铁调素水平对冠心病诊断治疗及预后判断有无意义至今尚无定论[10]。肝组织是铁调素合成和分泌的主要器官，也是脂质代谢的重要器官[11]。体内hepcidin水平降低时，血清铁水平呈负相关性增长，组织细胞出现铁沉积[12]。绝经后妇女血清hepcidin水平随动脉粥样硬化严重程度增减[13]。常规剂量阿托伐他汀钙降低维持型血液透析病人血清铁调素水平[14]，可调节铁调素水平变化降脂[15]，故采用阿托伐他汀作为对照组。血清转铁蛋白含量升高可以改善动脉粥样硬化，并降低动脉粥样硬化发生风险[16]。
本研究结果表明，胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高，血清铁调素亦升高，那么高脂血症的发生与铁调素间呈正相关。然而铁调素表达受多种因素影响，如机体铁水平、炎症、缺氧、EPO等。研究证实IL-6/stat3通路[17]、BMP/hjv/smad信号通路[18]是调节体内铁调素表达的主要途径。IL-6/stat3通路参与炎症反应，调节肝组织hepcidin表达[19]。长期以来，冠心病对机体造成损伤被认为与其慢性炎症状态相关，并参与调节hepcidin相关的白介素6及相关信号分子表达。高脂饮食是引起多种心脑血管病的重要病因，研究表明其会影响机体铁代谢，加重细胞铁沉积。但铁沉积是动脉粥样硬化发生发展的损害因子还是氧化应激下游产物有待进一步研究明确其具体机制。铁调素能否预测斑块的稳定性及成为冠心病治疗的有效靶点？
中医认为动脉粥样硬化多为本虚标实证，痰浊多为其始动因素，痰浊易阻滞气血运行，瘀阻脉络，形成血瘀。故治疗宜活血化痰。丹参又名赤参，古代医家有“一味丹参饮，共同四物汤”之说，可见其活血不伤正，兼顾补血之功效。现代药理学研究表明丹参具有良好的调脂作用。瓜蒌为栝蒌薤白类宽胸理气之君药，那么单体的瓜蒌能否通过中药多途径多靶点有效控制高脂血症延缓进程。故本课题组拟以丹参、瓜蒌及丹参瓜蒌配伍探求活血化痰配伍对高脂血症小鼠铁调素及相关信号通路的影响。为早期治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化开发新靶点、创新药物提供依据，以期为临床辨证和谴方用药提供客观支持。本研究应用fpn1基因敲出小鼠，建立高脂血症小鼠模型，探讨BMP/smad信号通路是否参与丹参、瓜蒌对损伤血管内皮的保护作用及其相关机制。
BMP骨形态发生蛋白是TGF-β家族成员，其下游靶分子smad1/5/8参与调节铁调素表达，bmp6/smad1/5/8通路在铁调素代谢为重要调节信号途径。研究结果表明丹参瓜蒌同煎能提高血浆中SOD活性，阻止脂质过氧化，逆转过度氧化应激。与模型组比较，灌服丹参瓜蒌同煎剂高脂血症小鼠血脂水平明显降低，血清铁调素含量明显下降，Western blotting检测磷酸化的smad1/5/8蛋白含量变化水平与肝组织免疫组化阳性染色bmp6蛋白表达量增减保持一致，提示丹参瓜蒌同煎组可能通过BMP/smad信号通路影响血脂代谢。由此间接推导高脂血症与铁调素的因果关系，丹参瓜蒌配伍可能通过调节铁调素水平影响脂质代谢。
高脂血症是冠心病的早期阶段，早期及时发现高脂血症和预防控制动脉粥样硬化的发生发展对改善缓解相关临床症状具有重要意义。早期检测的指标敏感性和特异性无疑是重要的。对于铁调素能否应用于临床，成为新药开发的作用靶点值得进一步研究。
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(本文编辑王雅洁)
Compatibility Effects of Danshen and Gualou on Hepcidin and Its Related Signal Pathway in Mice with Hyperlipidemia
Wang Lin，Ma Xiaojuan，Sun Mingyue，Miao Yang，Yin Huijun Gansu University of Chinese Medicine，LanZhou 730000，Gansu，China
Abstract：ObjectiveTo investigate the compatibility effects of Danshen and Gualou on hepcidin and its related bone morphogenetic protein(BMP)/Smad signal pathway in mice with hyperlipidemia induced by high-fat-diet，and to explore its possible mechanisms.MethodsFifty female Fpn1 Tek-cre mice were randomly divided into control group and model group.Eigh mice were fed with standard diet as control group， others were given high-fat-diet for 8 weeks to establish the hyperlipidemia models.After 8 weeks，the established mice were randomly divided into five groups and were intragastrically administered normal saline，atorvastatin suspension，Danshen decoction，Gualou decoction，Danshen Gualou decoction for 2 weeks，respectively.Blood was collected in sterile tubes， liver were removed and sacrificed by cervical dislocation， Serum lipids parameters were measured with an automated analyzer.The levels of interleukin-6 (IL-6)， hepcidin，malonaldehyde(MDA)， superoxide dismutase (SOD) were determined by enzyme linked immunosorbent assay.The liver expression position of bone morphogenetic protein 6 (BMP 6) was analysed by immunohistochemical method.Western blotting was to test the expressions of phosphorylation of Smad 1/5/8 and stat 3.ResultsCompared with the control group，the levels of total cholesterol (TC)， triglyceride (TG)， low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C)， hepcidin were increased in model groups(P<0.05).Compared with model group，the levels of hepcidin and BMP 6 were decreased in treatment groups(P<0.01 or P<0.05).Compared with atorvastatin group， the expressions of phosphorylation of stat 3 and Smad were decreased in Danshen Gualou decoction group(P<0.05).Compared with Danshen decoction group， the levels TC and hepcidin were decreased in Danshen Gualou decoction group(P<0.05).Compared with Gualou decoction group， the levels of TG，TC and hepcidin were decreased in Danshen Gualou decoction group(P<0.05).ConclusionDanshen and Gualou compatibility can regulate the expression of hepcidin and its related BMP/Smad signal pathway in mice with hyperlipidemia.
Key words：hyperlipidemia；hepcidin；Danshen；Gualou；bone morphogenetic protein/Smad signal pathway；mice
(收稿日期：2015-12-28)
Corresponding author：Yin Huijun(1.Gansu University of Chinese Medicine，LanZhou 730000，Gansu，China；2.Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)
中图分类号：R589R285
文献标识码：A
doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.07.010
文章编号：1672-1349(2016)07-0699-06
通讯作者：殷惠军， E-mail：huijunyin@yeah.net
基金项目：国家自然科学基金(No.81173584，81202837)；甘肃高校飞天学者特聘计划
·基础医学论着/研究·
