胡玉英，黄 河，宋正良，刘 辉，司冰洁，莫海珍
补肾止颤方联合埋针对帕金森病大鼠TH、GFAP表达的影响
胡玉英1，黄 河1，宋正良2，刘 辉3，司冰洁3，莫海珍3
目的 观察补肾止颤方联合埋针对帕金森病(PD)大鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的影响，探讨补肾止颤方联合埋针对PD大鼠神经元细胞的保护作用。方法 采用蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，免疫组织化学方法及蛋白印迹法检测各组大鼠中脑黑质区TH、GFAP表达的变化。结果 经补肾止颤方联合埋针治疗后的PD大鼠TH蛋白表达明显增加，TH阳性细胞明显增多，GFAP表达明显降低，GFAP阳性细胞明显减少，与模型组相比较有统计学意义(P<0.05)；而针药结合组与多巴丝肼组相比较，亦有统计学意义(P<0.05)。结论 补肾止颤方联合埋针可显着增加PD大鼠中脑黑质区TH阳性细胞表达，并有效减少GFAP阳性细胞表达，保护大鼠神经元细胞，增加脑内多巴胺(DA)含量，促进PD大鼠运动功能的恢复。
帕金森病；补肾止颤方；埋针；酪氨酸羟化酶；胶质纤维酸性蛋白
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球第二大神经退行性疾病，同时也是最常见的运动障碍性疾病。研究显示，我国PD发病率2/10万人～797/10万人年，随着年龄增高，PD的发病率呈上升趋势，在80岁及以上人群中患病率可达到1 663/10万人[1]。给家庭和病人造成了沉重的精神和经济负担。而本病至今尚局限于症状性的治疗，以左旋多巴替代性治疗为主，仍无特效的根治药物和方法，因此研究和开发安全有效的从根本上阻断多巴胺(DA)神经元变性，阻断PD病理进程的治疗措施尤为重要。本课题组前期研究显示：补肾止颤方联合埋针具有滋养肝肾、益精填髓、熄风止颤之功，能明显提高PD病人的运动功能和生活质量，显着改善病人的身心健康，通过不同靶点、不同途径、多环节起到抑制DA神经元细胞凋亡作用，治疗PD[2]，且能明显提高PD模型大鼠中脑黑质区Bcl-2蛋白的表达及抑制Bax蛋白激活，抑制黑质细胞凋亡以发挥脑保护作用[3]。本研究探讨补肾止颤方联合埋针对PD大鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 动物 成年雄性SPF级SD大白鼠32只，体重250 g±20 g，由广西医科大学实验中心提供。
1.1.2 药物及针具 ①补肾止颤方，组方：鹿角胶10 g，阿胶10 g，生龟板20 g，党参15 g，枸杞子30 g，白芍30 g，生地25 g，火麻仁15 g，麦冬15 g，炙甘草6 g，生鳖甲15 g，肉苁蓉30 g，天麻15 g，黄精10 g，山萸肉10 g，钩藤30 g。为单味免煎颗粒，由江苏省江阴市江阴天江药业有限公司制备，生产批号：1206003；参照《现代医学实验动物学》计算给药量，药物配制成含生药2.574 g/mL，灌胃液体量为每次1 mL/100 g大鼠，其浓度及等效剂量按体表面积折算。②多巴丝肼片由上海罗氏制药公司提供(批准文号：国药准字 SH10930198，批号：SH2099)，每片250 mg；③埋针针具：选取图钉型无菌揿针针具(苏州市华伦医疗用品有限公司生产的顺和牌无菌揿针，批号：11101)。
1.1.3 主要试剂 PSI购自Calbiochem公司；TH和GFAP免疫组化抗体购自北京博奥森生物技术有限公司； TH多克隆抗体(美国Chemicon公司)，GFAP多克隆抗体(anit-GFAP，美国BioVision)，β-actin(美国Sigma公司)；其他试剂均为市售、分析纯化。
1.1.4 主要设备 组织包埋机和自动组织脱水机(广州市华俊医疗器械有限公司)，组织切片机(LEICA RM2235)，生物组织烤片机(湖北省孝感市亚光医学电子技术有限公司)，三用电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械厂)，光学显微镜(OLYMPUS BX60)。
1.2 方法
1.2.1 动物筛选 大鼠购进后饲以标准的大鼠合成饲料常规饲养，观察1周无异常后进行实验，整个实验过程中动物自由摄食饮水。实验期间每日观察并记录各组大鼠的体毛、梳理动作、站立次数、肢体震颤、僵直等行为。造模结束后的4周内未出现行为学改变的模型为制作失败，不纳入本实验，同时术中死亡大鼠及时补充，用同一批次的大鼠制成成功模型后，保证实验动物每组数量不变。
1.2.2 埋针处方 百会、肝俞、肾俞、舞蹈震颤区(取穴参照华兴邦的《大鼠穴位图谱》)。
1.2.3 模型制备、分组及干预 参照刘雨清等[4]PSI皮下注射法(PSI溶液配制方法：将室温放置的100%无水乙醇直接倒入PSI小瓶中，迅速旋转溶解，观察确定其完全溶解无颗粒残存)。制作慢性PD大鼠模型，隔日(每周一、三、五)给予24只大鼠背部皮下注射PSI溶液，75 μL/100 g，连续2周。将造模成功的大鼠随机分为3组，即模型组、多巴丝肼组、针药结合组；另设8只大鼠为假手术组，予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。各组大鼠在造模结束4周后进行行为学观察，根据造模成功标准[3]，筛选合格的PD大鼠(活动减少，运动迟缓，重心降低，肢体僵硬)。各组在造模4周后连续给药3周，假手术组、模型组均予1 mL/100(g·d)生理盐水灌胃；多巴丝肼组予多巴丝肼200 mg/(kg·d)灌胃；针药结合组予补肾止颤方溶液1 mL/100(g·d)灌胃，同时予埋针疗法，隔天(每周一、三、五)治疗，连续3周，最后每组8只大鼠进行实验。各组大鼠灌胃给药3周后，予10%水合氯醛(0.35 mL/100 g体重)经腹腔注射深度麻醉大鼠后仰卧固定于手术台上，暴露心脏，止血钳夹住腹主动脉及下腔静脉，用磨顿的10号针头刺入左心室，先快速滴入生理盐水约100 mL，见到大鼠两前肢及两肺变白改灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH7.4)100 mL，灌洗后快速断头取大脑，置于4%的多聚甲醛中固定、脱水、透明并石蜡包埋备用。
1.3 观察方法
1.3.1 动物行为学观察 实验期间每日观察并记录各组大鼠的采食量、体毛、梳理动作、站立次数、肢体震颤、僵直等行为。
1.3.2 免疫组织化学染色法 采用免疫组织化学染色法SABC法[5]检测各组大鼠中脑黑质区TH蛋白、GFAP表达的变化，在光学显微镜高倍镜下随机取2 mm×2 mm视野，计算中脑黑质区的TH、GFAP的阳性细胞数，并采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，测定TH、GFAP免疫组化染色的阳性细胞数。
1.3.3 蛋白印迹法(western blot) 取中脑黑质区组织标本加入蛋白裂解液后，用玻璃匀浆器充分匀浆至完全裂解，匀浆离心后取上清，定量，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭后，分别用TH多克隆抗体(按1∶2 000稀释)；GFAP多克隆抗体(1∶1 000稀释)，充分洗涤后用辣根过氧化物酶偶联的IgG作为二抗，增强化学发光法显色(promega公司)，曝光，显影，定影，结果采用ImageJ软件分析。
2 结 果
2.1 动物行为学观察 造模大鼠注射PSI结束后，逐渐出现不自主咀嚼，站立次数、梳理动作增多；PSI注射结束后第4周症状较明显，大鼠主要表现为采食量减少，毛发粗糙无光泽、污秽，不自主咀嚼、站立次数、梳理动作增多，前爪出现颤抖，行走时重心明显降低，伸展姿态时腹部接触地面，运动迟缓，肢体和躯体的伸展缓慢。
2.2 TH免疫组化检测结果 光镜下观察可见假手术组大鼠中脑黑质区TH阳性细胞在细胞浆内呈棕褐色染色，细胞排列整齐密集，形态正常，边缘清晰，核仁较小且居中，细胞体呈梭形或锥形，突起多且明显，长而连续，稍有分支，细胞纤维细长、集中、交织呈网状(见图1)；而模型组TH阳性细胞数目显着减少，细胞的突起和神经纤维均减少，细胞膜出现明显皱缩，细胞体积明显缩小(见图2)；而多巴丝肼组和针药结合组则均有不同程度的改善，尤以针药结合组改善明显(见图3～图4)。
图1 假手术组TH免疫组化检测结果(×400)
图2 模型组TH免疫组化检测结果(×400)
图3 针药结合组TH免疫组化检测结果(×400)
图4 多巴丝肼组TH免疫组化检测结果(×400)
2.3 GFAP免疫组化检测结果 光镜下观察可见假手术组大鼠中脑黑质区GFAP阳性细胞染色较淡，呈棕褐色或棕黄色染色，细胞排列整齐密集，形态正常，边界清晰，细胞分布比较分散，数目较少，且胞体较小，呈不规则的多角形形状，突起呈星形且较少(见图5)；而模型组大鼠黑质GFAP阳性细胞数明显增多，胞体增大，突起增长呈蜘蛛样，且染色加深呈深棕黄色(见图6)；而多巴丝肼组及针药结合组皆有不同程度改善，尤以针药结合组改善明显(见图7～图8)。
图5 假手术组FAP免疫组化检测结果(×400)
图6 模型组FAP免疫组化检测结果(×400)
图7 针药结合组FAP免疫组化检测结果(×400)
图8 多巴丝肼组FAP免疫组化检测结果(×400)
2.4 TH及GFAP阳性细胞数 TH及GFAP表达部位在黑质细胞的胞质。与假手术组比较，模型组、多巴丝肼组及针药结合组TH阳性细胞数均明显减少，GFAP阳性细胞数均明显增多，均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针药组及多巴丝肼组TH阳性细胞数均明显增多，GFAP阳性细胞数均明显减少，有统计学意义(P<0.05)；与多巴丝肼组比较，则针药结合组TH阳性细胞数明显增多，GFAP阳性细胞数明显减少，亦有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图9。
图9 TH及GFAP蛋白Western blot检测结果
2.5 TH及GFAP的Western blot检测结果(蛋白表达的灰度值/β-actin灰度值的相对值) 与假手术组比较，模型组、多巴丝肼组及针药结合组TH蛋白表达均明显降低，GFAP表达均明显增加，均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针药结合组及多巴丝肼组TH蛋白表达显着增加，GFAP表达显着降低，有统计学意义(P<0.05)；而与多巴丝肼组比较，则针药结合组TH蛋白表达明显增加，GFAP表达明显降低，亦有统计学意义(P<0.05)。详见表2。
表2 各组TH的GFAP Western blot检测结果
3 讨 论
PD早期主要病理改变是黑质多巴胺能神经元变性、缺失。而TH为DA合成的限速酶，同时还是脑内DA能神经元的蛋白标志，是PD的直接指示剂，PD发病时TH含量下降且随着病情进展而显着下降，它的增加和减少直接影响DA的数量，故其含量与功能不足是导致PD一系列临床症状的重要环节。大量研究证明，PD动物模型中脑黑质TH阳性神经元表达数量显着减少[6-8]。本研究显示PD大鼠中脑黑质区TH阳性细胞明显减少，TH蛋白表达水平降低，与上述相同，说明PSI有导致黑质细胞凋亡的作用，从而使DA神经元减少，最终导致PD的发生，出现明显的PD大鼠
行为学特征，进一步提示TH表达的降低与PD发病密切相关。而PD的发生尚与多种因素有关，如免疫炎症反应、一氧化氮(NO)、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、线粒体功能衰竭等。GFAP是构成星形胶质细胞胞体胶原蛋白的重要成分，且其仅存在于星形胶质细胞胶质原纤维中间丝中，是星形胶质细胞活化的特征性标记物[9-10]，对神经元具有炎性损坏作用，并在神经元突触发生、界定神经核团形成以及PD的发生发展方面都具有明显作用；GFAP阳性反应的细胞又称为反应性星形胶质细胞，它可以分泌致炎因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、巨噬细胞炎性蛋白等，它的异常活化及炎性因子的释放所构成的神经炎症反应对大脑健康不利，使神经元变性[11]；反应性星形胶质细胞还可大量释放NO，并与阴离子结合形成氧自由基，破坏线粒体膜功能，造成线粒体功能衰竭，导致黑质神经元细胞损伤；另一方面，它还能合成谷氨酸，对神经元膜上受体具有激活作用，进而产生细胞毒性作用，导致神经元广泛损伤和死亡，从而诱导PD的发生。本研究显示PD大鼠中脑黑质区GFAP阳性细胞显着增多，GFAP表达水平增高，出现明显的PD大鼠行为学特征，表明星形胶质细胞通过免疫炎症因素、破坏线粒体功能及兴奋性氨基酸细胞毒性作用参与DA神经元的凋亡，导致PD的发生。
TH阳性细胞表达的多少不仅体现DA能神经元被破坏的程度，同时可用来判定PD治疗效果[12]，因此设法提高TH蛋白含量及酶活性已成为PD治疗研究的重要领域[13]。近年来各项研究不断揭示中药、针灸治疗PD疗效确切。已有多项实验研究支持中药单体、有效成分及组方可提高动物脑内DA含量[14]。文晓东等[15]对于中医药治疗PD疗效进行了系统评价，认为中医药治疗PD安全、有效，中药联合PD基础西药可能优于单用西药，对于早期PD病人，采用单纯中药治疗与西药(多巴丝肼)疗效相当。陈伶利等[16]研究表明针刺阳陵泉能显着增加PD模型小鼠黑质区TH阳性细胞数，并减少GFAP阳性细胞数，保护DA能神经元，改善PD症状，从而治疗PD。
本研究结果显示，针药结合组中脑黑质区TH阳性细胞、TH蛋白表达水平显着增加，GFAP阳性细胞、GFAP表达水平显着减少，提示补肾止颤方联合埋针能明显促进TH蛋白表达并有效抑制GFAP表达，考虑针药结合可能通过显着抑制星形胶质细胞的活化及致炎因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、巨噬细胞炎性蛋白的分泌及NO的释放，从而抑制GFAP参与炎症反应，并减少NO所致的脂质过氧化和对线粒体功能的破坏以及兴奋性氨基酸的细胞毒性作用，减少DA神经元损伤、变性及死亡，保护DA神经元；DA能神经元自血流摄入左旋酪氨酸，在TH作用下形成左旋多巴(L-dopa)，再经多巴胺脱羧酶(DDC)作用生成DA，使DA神经元明显增加，对黑质细胞具有明显保护作用，从而治疗PD。
补肾止颤方联合埋针能明显促进PD大鼠中脑黑质区TH蛋白表达及有效抑制GFAP表达，使DA神经元凋亡明显减少，对黑质细胞具有明显保护作用，改善PD临床症状、延缓PD进展。其机制可能与补肾止颤方联合埋针能减少免疫炎症反应、兴奋性氨基酸的细胞毒性作用及对线粒体功能的破坏有关。
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(本文编辑王雅洁)
Effects of Bushen Zhichan Formula and Needle-embedding Therapy on TH and GFAP in Rats with Parkinson’s Disease
Hu Yuying，Huang He，Song Zhengliang，Liu Hui，Si Bingjie，Mo Haizhen
First Affiliated Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530023，Guangxi，China
Hu Yuying
Objective To observe the effects of Bushen Zhichan formula (BZF) and needle-embedding therapy on tyrosine hydroxylase (TH)and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in midbrain nigra area of rat model of Parkinson's disease (PD)，and analyze its protective effect on neuron of PD rats. Methods After treatments for three weeks，TH and GFAP changes in midbrain nigra area of each group of PD rats which were modeled by injecting proteasome inhibitors I (PSI)，were tested by immunohistochemistry and western blot. Results The expression of TH in BZF and needle-embedding therapy group was significantly increased，and so did the TH positive cells，with the expression of GFAP having a dramatic decline and so did its positive cells. Compared with the model group，there was significant differences in all the figures (P<0.01). There was significant differences between BZF and needle-embedding group and levodopa and benserazide group (P<0.05). Conclusion BZF and needle-embedding therapy can up-regulate the expression of TH positive cells while reduce the expression of GFAP positive cells in the midbrain nigra area of PD rats. It can also protect the neuron of PD rats，increase the volume of dopamine (DA) in their brain and promote the recovery of motor function for them.
Bushen Zhichan formula；Parkinson’s disease； needle-embedding therapy； tyrosine hydroxylase；glial fibrillary acidic protein
1.广西中医药大学第一附属医院(南宁 530023)；2.广西壮族自治区柳州鹿寨县中医院； 3.广西中医药大学
胡玉英，E-mail：13878847908@163.com
R742.5 R285.5
A
10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.013
1672-1349(2017)03-0305-05
2016-04-19)
引用信息：胡玉英，黄河，宋正良，等.补肾止颤方联合埋针对帕金森病大鼠TH、GFAP表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(3)：305-309.
