，
·基础医学论着/研究·
DARPP-32磷酸化与止颤汤改善大鼠帕金森病运动并发症的研究
黄宁静，陆小青
目的观察纹状体多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)(Thr34)磷酸化与止颤汤对大鼠帕金森病运动并发症的影响。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠脑部黑质造成帕金森病(PD)模型，进一步予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射制作异动症(LID)模型。实验设立正常组，LID模型组，LID西药组及小剂量中药组、中剂量中药组、大剂量中药组，并采用免疫组化法观察各组大鼠DARPP-32(Thr34)磷酸化的表达情况。结果免疫组化显示，假手术组DARPP-32(Thr34)磷酸化表达明显低于模型组(P<0.01)。中药小剂量组、中剂量组、大剂量组DARPP-32磷酸化表达与西药组表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量组磷酸化与小剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论止颤汤可有效降低纹状体DARPP-32(Thr34)磷酸化的表达，可能是止颤汤治疗异动症的机制。
帕金森病；止颤汤；异动症；多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前中老年的一种多发病，是一种以静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常为主要临床特征的疾病，已成为继阿尔海默茨病后影响老年人心身健康的第二大神经行性功能障碍疾病[1]。目前PD治疗以左旋多巴为主的替代治疗，长期使用左旋多巴，引起症状波动和异动症(LID)，异动症是一种舞蹈样、手足徐动样或简单重复的不自主动作，较多的中晚期病人因此致残[2]。
LID发病机制尚不完全明确，临床上也未有推广的治疗药物及技术，因此异动症是帕金森病运动并发症的一个难关，故中医药治疗异动症是一个切入点。有研究发现，纹状体环磷酸腺苷(cAMP)依赖性蛋白激酶(PKA)通路和其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)蛋白Thr34位点磷酸化表达的改变可能参与异动症发病[3-4]。本实验通过采用止颤汤治疗异动症大鼠，观察实验大鼠纹状体DARPP-32(Thr34)磷酸化表达变化，旨在探讨其治疗LID的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠50只，体重180 g～220 g，由斯莱克实验动物有限责任公司提供，经反复行为检测确认无旋转行为。
1.2 药物配制 止颤汤为上海市中医医院名老中医李如奎教授经验方，由上海市中医医院提供，中剂量组药物：黄芪15 g，丹参9 g，钩藤18 g，知母12 g，白芍12 g，制大黄15 g，升麻9 g，水煎浓缩至每1 mL含生药1.28 g。大小剂量组药物剂量分别为在中剂量组基础上增减20%，储存于冰箱备用。
1.3 方法
1.3.1 PD大鼠模型制备 腹腔注射2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，平卧位固定于脑立体定位仪上。大鼠头部局部常规消毒后，剪开头皮，剥离骨膜，参照包新民等[5]所着大鼠脑立体定位图谱确定左侧黑质致密部(SNC)和黑质纹状体通路(VTA)两坐标：①SNC前囟后5.0 mm，矢状缝左侧1.7 mm，颅骨表面下7.6 mm；②VTA前囟后4.6 mm，矢状缝左侧0.9 mm，颅骨表面下7.5 mm；并根据大鼠体重和头颅大小在规定范围内确定具体坐标并以三棱针进行标记，使用牙科钻小心钻透颅骨，按确定坐标将微量注射器缓慢进入预定深度，实验组向每个位点注射lactacystin 8 μg(4 μL)；对照组则注射等体积生理盐水，深度以针孔斜面中点为参照点，以颅骨下硬脑膜处为零点，以1 μL/min速度缓慢旋转推药，注射完毕后留针10 min，缓慢退针，术后常规缝合伤口，连续腹腔注射青霉素[10×104U/(kg·d)]，持续1周预防感染，局部伤口每日碘酒消毒1次，7 d后拆线。术后1周起，每隔7 d 09：00检测行为学，阿扑吗啡(APO)0.5 mg/kg腹腔注射。在直径为40 C1TI容器观察大鼠旋转行为。记录注射后5 min大鼠旋转次数，同时观察其行为学变化，连续测试3周。若连续观察30 min，大鼠恒定向右侧旋转，平均转速>7 r/min，视为成功PD模型大鼠；平均转速<7 r/min的右转鼠或左转鼠；不转鼠均被淘汰。
1.3.2 LID大鼠模型制备 采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)制备PD模型大鼠[6]，2周后进行行为学观察：按0.5 mg/kg腹腔注射APO，记录1 h内大鼠旋转总圈数，>100 r/h即为PD模型制作成功。同时随机选取6只大鼠采用生理盐水代替6-OHDA注射作为正常组(假手术组)。将左旋多巴和苄丝肼溶于含0.2%维生素C的消毒生理盐水中，使左旋多巴终浓度为10 mg/mL，苄丝肼为2.5 mg/mL。3周后对造模成功的PD大鼠腹腔注射左旋多巴甲酯(按体质量50 mg/kg)/苄丝肼(按体质量12.5 mg/kg)4周，每日两次(09：00与17：00)，制备LID大鼠模型[7]。随机将LID模型分为：LID模型组、LID西药组、中药小剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组，每组6只。LID模型组大鼠给予腹腔注射含0.2%维生素C的消毒生理盐水，持续29 d；LID西药组为腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼，每日两次(09：00与17：00)，持续29 d；中药小剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组在给予左旋多巴甲酯/苄丝肼基础上分别加用止颤汤灌胃，每日1次，持续29 d，每次灌胃量为9 mL/kg。
1.4 测试指标 免疫组化检测：石蜡包埋组织，常规切片，厚度4 μm，65 ℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，30 mL/L H2O2中封闭内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液高压修复抗原兔抗DARPP-32(Thr34)抗体，4 ℃孵育过夜，洗涤后加入生物素标记二抗，室温孵育30 min，DAM显色剂显色，脱水、干燥、封片，分别在光学显微镜下观察。按下列公式计算：GRK6蛋白阳性细胞指数(IOD)：IOD=阳性细胞面积×校正吸光度(A)值，校正A值=A测量区-A背景。
2 结 果
各组大鼠免疫组化比较免疫组化显示，假手术组DARPP-32(Thr34)磷酸化表达(3.89±0.13)×104，明显低于模型组(8.65±0.35)×104(P<0.01)。西药组磷酸化表达[(8.55±0.28)×104]与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。中药小剂量组、中剂量组、大剂量组DARPP-32磷酸化表达分别为(7.66±0.25)×104、(5.25±0.18)×104、(5.05±0.15)×104，与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量组磷酸化与小剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与大剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1。
图1 各组大鼠纹状体区DARPP-32(Thr34)磷酸化表达
3 讨 论
帕金森病是中老年人的常见疾病，其患病率随年龄增长而逐渐增高，其病理改变主要出现在黑质纹状体系统，为黑质多巴胺神经元变性引起的黑质纹状体系统多巴胺递质含量显着减少[8-9]。自20世纪60年代以来，左旋多巴一直是治疗帕金森病有效的药物之一，但长期使用左旋多巴，逐渐出现疗效减退及运动并发症等不良反应，其中最突出的运动并发症是LID[10]，许多中晚期病人因此致残。
近年来有研究结果表明，LID发生与黑质纹状体的直接通路活性改变有关[11]。多巴胺和环磷腺苷调节的DARPP-32是直接通路上信号传导的重要物质，直接参与并调控直接通路的活化程度。Lundblad等[12]研究表明，长期使用左旋多巴治疗PD大鼠，出现不自主运动(AIM)与人类LID行为相似，可作为模型研究LID机制。
DARPP-32是直接通路上重要的信号传导物质，大量集中于纹状体区，直接参与并调控直接通路的活化程度[3，13]。多巴胺D1受体激活后，活化腺苷酸环化酶，生成cAMP，从而激活蛋白激酶(PKA)，PKA可促进DARPP-32的Thr34位点磷酸化[4]，同时降低Thr75位点磷酸化。DARPP-32的Thr34位点磷酸化后成为蛋白磷酸酶1(PP-1)的高效抑制剂，后者可调控神经元磷酸蛋白的磷酸化状态，从而激活直接通路。此外，DARPP-32的Thr75位点磷酸化后成为PKA抑制剂，其磷酸化程度降低可减轻对PKA的抑制作用，从而间接强化直接通路。可见磷酸化位点不同，有对直接通路相反作用。有实验表明，异动症大鼠脑部纹状体DARPP-32的Thr34位点磷酸化水平增高，可能造成直接通路过度活化，引起直接、间接通路的平衡失调及清除异常运动信息的功能破坏，最终导致LID发生[14]。
复方中药具有多靶点，整体治疗特点。中医药重视整体调理，中药组方配伍灵活，对疾病可兼顾局部和整体，进行综合干预。治疗帕金森病运动并发症也颇有疗效。根据临床表现和体征，PD属于中医“颤证”范畴[15]。早在《内经》中就有记载，《素问·至真要大论篇》曰：“诸风掉眩，皆属于肝”，其病机通常认为是本虚标实，本虚是指肝肾精血不足与气血亏虚，标实常指痰热夹风阳为患，其病位在脑，与肝、脾、肾三脏有关。
止颤汤是我科上海市名老中医李如奎教授，结合多年治疗PD经验，经过探索筛选研制所得，在我科近几十年临床运用于帕金森病及异动症病人颇有疗效[16]。止颤汤由黄芪、丹参、钩藤、知母、白芍、制大黄、升麻等组成。方中黄芪补气，丹参、白芍活血补血，而《本草纲目》曰：“知母之辛苦寒凉，下则润肾燥而滋阴，上则清肺金而泻火”，白芍缓急、柔筋，知母养阴清热，合钩藤以奏熄风平颤之功；大黄泻浊火，使清阳之府静谧；升麻升清阳，配伍黄芪等补气之品，使清气得升，脑髓得补。全方补气血，滋肾阴，平肝风，升清阳，泻浊火，并可改善病人便秘、乏力诸症。方中不少药物兼有多种功效，如黄芪兼有补气与熄风之功，白芍兼有养血和止痉之效。现代药理学证实白芍具有抗惊厥、解痉作用；升麻可清热解毒；知母亦有镇静之能。李如奎教授指导下，已有国家及地方各级课题和多篇论文提示止颤汤对帕金森病大鼠模型有治疗作用，并成功制作PD大鼠及LID大鼠模型[17]，因此该研究将止颤汤进一步应用于LID大鼠，旨在探索LID的发病机制及止颤汤的作用途径。
本实验结果显示，纹状体磷酸化DARPP-32(THr34)表达的免疫组化研究表明，正常组(假手术组)磷酸化表达明显低于LID模型组(P<0.01)；而西药组磷酸化与LID模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明LID时DARPP-32(THr34)表达有所增加；而中药组治疗后THr34磷酸化表达降低，提示中药治疗可降低磷酸化DARPP-32(THr34)的表达，抑制PKA通路的过度活化，缓解LID的进一步加重。中药中剂量组、大剂量组可显着降低THr-34磷酸化表达，与小剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示与中剂量组比较，小剂量组降低磷酸化表达效果不如中剂量组，大剂量降低水平基本等同中剂量。
综上所述，黑质病变严重程度是LID发病基础，而左旋多巴的波动性刺激是其发病的始动因素，直接和间接纹状体输出通路的失衡可能是异动症产生的主要病理机制[18-19]，而DARPP-32(THr34)水平的变化是直接通路过度活化的关键因素。因此止颤汤通过调控DARPP-32的磷酸化状态或拮抗直接通路活性，逆转通路活动失衡有可能减轻LID症状。
[1] Thanvi B，Lo N，Robinson T.Levodopa-induced dyskinesia in Parkinson’s disease：clinical features，pathogenesis，prevention and treatment[J].Postgrad Med J，2007，83(980)：384-388.
[2] Olanow CW，Obeso JA.Preventing levodopa—induced dyskinesias[J].Ann Neurol，2000，47(4)：167-178.
[3] 梁直厚，管强，曹学兵，等.异动症大鼠直接通路中DARPP-32蛋白变化的机制[J].中国康复医学杂志，2006，21(11)：963-966.
[4] 牛轶碹，曹学兵，魏桂荣，等.DARPP-32磷酸化状态与左旋多巴诱发异动症形成间关系的研究[J].脑与神经疾病杂志，2008，16(1)：1-4.
[5] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社，1991：49-59.
[6] 陈生弟，陈先文.帕金森病动物模型的研制[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2003，10(1)：28-32.
[7] 孙慧勤，陈先文，李芳，等.左旋多巴诱发异动症大鼠模型的制作及其行为学研究[J].安徽医科大学学报，2009，44(3)：355-358.
[8] LEE CS，Cenei MA，Schulzer M，et al.Embryonic ventral meseneephalie grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson’s disease[J].Brain，2000，123(7)：1365-1379.
[9] Lee AC，Harris JP，Calvert JE.Impairment of mental rotation in Parkinson disease[J].Neuropsychologia，1998，36(1)：109-114.
[10] Amick MM，Schendan HE，Ganis G，et al.Frontostriatal circuits are necessary for visuomotor transform ation：mental rotation in Parkinson’s disease[J].Neuropsychologia，2006，44(3)：339-349.
[11] Brotchie JM，Lee J，Venderova K.Levodopa-induced dyskinesia in Parkinson’s disease[J].J Neural Transm，2005，112(3)：359-391.
[12] Lundblad M，Andersson M，Winkler C，et al.Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson’s disease[J].Eur J Neurosci，2002，15(1)：120-132.
[13] 浦政，陆丽霞，刘振国，等.脑深部电刺激对异动症大鼠纹状体DARPP-32及其磷酸化蛋白表达的影响[J].上海交通大学学报(医学版)，2009，29(7)：817-820.
[14] 陈志斌，管强，曹学兵，等.异动症大鼠模型基底节DARPP-32蛋白磷酸化状态的变化[J].中国现代医学杂志，2007，17(5)：536-539.
[15] 陈湘君，蔡淦.中医内科学[M].上海：上海科学技术出版社，2001：1-5.
[16] 刘毅，王慧新，李如奎.止颤汤治疗帕金森病的临床疗效观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2007，5(11)：1064-1065.
[17] 李文涛，汪洋，施慧芬，等.止颤汤对神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化作用的研究[J].世界科学技术—中医药现代化，2009，11(3)：371-374.
[18] Thanvi BR，Lo TC.Long term motor complications of levodopa：clinical features mechanisms，and management strategies[J].Postgrad Med J，2004，80(946)：452-458.
[19] 巴茂文，刘振国.左旋多巴诱发异动症的病理生理机制研究进展[J].中华神经科杂志，2005，38(6)：403-404.
(本文编辑薛妮)
Effects of Zhichan Decoction on the Phosphorylation of DARPP-32 and Dyskinesia in Parkinsonian Rats
Huang Ningjing，Lu Xiaoqing
Shanghai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200434，China
Lu Xiaoqing
ObjectiveTo study the effects of Zhichan decoction (ZCD) on the phosphorylation of the dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of 32 kDa (DARPP-32) at Thr34 in striatum of Parkinsonian rats with abnormal involuntary movements (AIM).MethodsSix unilatera1 hydroxydopamine-lesioned rat，the mode1 of Parkinson disease (PD)，were treated with levodopa/benserazide in order to establish the rats models with levodopa-induced dyskinesia (LID).LID rats were randomly divided into 5 groups: LID model groups treated with saline，levodopa group and ZCD low doses group，ZCD medium doses group and ZCD high doses group，respectively.Five rats with sham-operation were served as controls.Rats were then sacrificed，and immunohistochemica1 techniques was used to measure the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in LID model group was higher than that in control group (P<0.01).The expressions of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in ZCD groups were lower than that in levodopa group (P<0.01).The expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in ZCD medium doses group was lower than that in ZCD low doses group (P<0.05).ConclusionZCD can down-regulate the expression of phosphorylated DARPP-32 at Thr34 in striatum in Parkinsonian rats with LID.
Parkinson’s disease；Zhichan decoction； dyskinesia；dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of 32 kDa
第五批上海中医药大学后备业务专家培养计划项目；上海市卫生局科教处青年项目(No.20134Y164)
上海市中医医院(上海 200434)
陆小青，E-mail：0917@szy.sh.cn
信息：黄宁静，陆小青.DARPP-32磷酸化与止颤汤改善大鼠帕金森病运动并发症的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(17)：2110-2113.
R742.5 R285.5
：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.007
：1672-1349(2017)17-2110-04
2016-11-22)
