川崎病患儿外周血miR-145和心肌素的表达及其与冠状动脉损害的关系

陈 建，李 刚

川崎病又名皮肤黏膜淋巴综合征，是儿科常见的一种全身免疫系统中小血管炎性疾病，多发于5岁以下儿童，以发热、皮疹、淋巴结肿大、手足硬性水肿为临床表现，病理改变可涉及全身多器官系统，其中以冠状动脉损害最为常见。研究表明，川崎病患儿冠状动脉损伤发生率高达30%，一般以冠状动脉扩张或冠状动脉瘤为主，已成为导致患儿死亡的重要心血管并发症[1]。目前临床上对于川崎病患儿是否可能并发冠状动脉损害尚无特异性预测指标，仅仅依靠医生临床经验及部分明显性症状出现后才能确诊，治疗难度大，因此，亟须寻找一种可特异性反映川崎病患儿并发冠状动脉损害的生物学指标来对患儿进行早期预测，以加强监测，改善治疗效果，降低患儿死亡率。微小核糖核酸-145(microRNA-145，miR-145)是在血管平滑肌细胞中表达较为丰富的一种microRNA，可作为血管平滑肌细胞由收缩表型转化为分泌表型的一种重要标志物，通过多种机制参与心血管疾病发展过程[2]。心肌素基因最早克隆自小鼠心脏cDNA，属核蛋白SAP结构域家族，可通过激活miR-145表达促进血管平滑肌细胞分化，参与受损血管修复过程[3]。以往临床上对miR-145和心肌素的研究多集中于冠状动脉粥样硬化、心肌缺血或肿瘤等疾病，在川崎病患儿中研究较少。因此，本研究拟通过检测川崎病患儿血清miR-145及心肌素水平，分析二者表达情况与川崎病患儿冠状动脉损害的关系。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 川崎病诊断标准：参照2002年日本川崎病研究委员会修订的第5版诊断标准[4]，①持续发热≥5 d；②双侧眼结膜充血；③出现杨梅舌，口腔咽部黏膜呈弥漫性充血；④出现皮疹、红斑等皮肤性变化；⑤急性期患儿四肢出现硬性水肿，恢复期患儿皮肤移行处出现膜样脱皮；⑥单侧颈部出现直径>1.5 cm的非化脓性淋巴结肿大。满足以上任意5条即可确诊为川崎病。合并冠状动脉损害诊断标准[5]：采用超声心动图检查冠状动脉，若①冠状动脉内膜回声增强，冠状动脉腔呈现明显不规则；②某一段冠状动脉内径超过相邻段1.5倍；③3岁以下患儿表现为冠状动脉内径超过2.5 mm，3～9岁患儿超过3 mm，9～14岁患儿超过3.5 mm。

纳入标准：①符合上述标准确诊为川崎病患儿；②年龄≤5岁患儿；③纳入研究前未进行过影响本次研究结果的治疗患儿；④患儿及监护人同意本次研究，并签署知情同意书。排除标准：①合并血液系统疾病、自身免疫疾病患儿；②合并肝、肾等重要器官严重病变患儿；③依从性差患儿。

1.2 临床资料 选取2015年5月—2018年10月眉山市妇幼保健院和西南医科大学附属医院收治的川崎病患儿72例为研究对象，按照是否出现冠状动脉损害分为无损害组和损害组。无损害组40例，男23例，女17例；年龄5～57(32.19±6.45)个月。损害组32例，男18例，女14例；年龄6～60(33.28±6.77)个月。另选同期在眉山市妇幼保健院体检性别、年龄相仿的健康志愿者40名为对照组，男22名，女18名；年龄5～60(33.75±6.92)个月。3组研究对象在年龄、性别等基本资料方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.3 研究方法

1.3.1 临床生化指标收集 采用全自动生化分析仪收集C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白细胞计数(white blood cell，WBC)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血小板计数(blood platelet，PLT)等常规临床生化指标，对照组数据均于体检当日获得。

1.3.2 炎症相关因子 抽取颈静脉血，采用酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，试剂盒均购自深圳科润达生物工程有限公司。

1.3.3 血清miR-145水平 抽取颈静脉血，采用荧光定量PCR技术测定血清miR-145表达水平，逆转录试剂盒购自北京博尔迈生物技术有限公司，并严格按照操作说明书进行逆转录。定量PCR条件首先是94 ℃预变性3 min，然后按照94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s的程序进行，反应共设置40个循环，以U6为内参，引物序列如下，miR-145正向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反向引物：5′-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3′，U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 血清心肌素水平 采集患儿入院后颈静脉血，采用酶联免疫吸附法检测血清心肌素水平，试剂盒购自上海盈公生物技术有限公司。

2 结 果

2.1 3组临床生化指标检测结果比较 冠状动脉损害组患儿血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠状动脉无损害组和对照组(P<0.05)，且冠状动脉无损害组高于对照组(P<0.05)。详见表1。

组别例数CRP(mg/L)WBC(×109/L)PLT(×109/L)ESR(mm/h)对照组 402.51±0.57 15.79±3.18 222.54±40.87 11.38±2.06 无损害组409.74±2.86①28.19±5.62①310.12±61.53①27.94±5.22①损害组 3220.55±4.29①②37.83±7.24①②435.51±84.99①②52.73±10.49①②F值350.461147.689100.786358.074P 0.000 0.000 0.000 0.000

与对照组比较，①P<0.05；与无损害组比较，②P<0.05。

2.2 3组血清炎症相关因子水平比较 冠状动脉损害组血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠状动脉无损害组和对照组(P<0.05)，且冠状动脉无损害组高于对照组(P<0.05)。详见表2。

组别例数IL-6IL-8IL-10TNF-α对照组 4023.59±4.46 10.37±1.96 9.77±1.85 11.46±2.35 无损害组4048.91±9.73①25.48±5.03①21.07±4.13①20.84±4.11①损害组3265.42±13.01①②38.14±7.52①②30.21±5.88①②29.78±5.63①②F值181.035262.289220.088176.289P 0.000 0.000 0.000 0.000

与对照组比较，①P<0.05；与无损害组比较，②P<0.05。

2.3 3组血清miR-145及心肌素水平比较 冠状动脉损害组血清miR-145及心肌素水平低于冠状动脉无损害组和对照组(P<0.05)，且冠状动脉无损害组低于对照组(P<0.05)。详见表3。

组别例数miR-145相对表达量心肌素(ng/L)对照组402.65±0.51267.45±51.28无损害组401.97±0.39①154.59±32.08①损害组321.08±0.22①②85.64±17.96①②F值135.903219.178P 0.000 0.000

与对照组比较，①P<0.05；与无损害组比较，②P<0.05。

2.4 相关性分析 miR-145在川崎病患儿血清中表达水平与心肌素水平呈正相关(P<0.01)，在冠状动脉损害组中相关系数为0.847。详见图1。在冠状动脉无损害组中相关系数为0.792。详见图2。

图1 冠状动脉损害组川崎病患儿血清中miR-145与心肌素的相关性分析

图2 冠状动脉无损害组川崎病患儿血清中miR-145与心肌素的相关性分析

2.5 Logistic回归分析结果 以川崎病患儿是否并发冠状动脉损害为应变量，以患儿年龄、血清CRP、WBC、PLT、ESR、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、miR-145及心肌素水平为自变量行Logistic回归分析，结果显示，低水平的血清miR-145及心肌素是川崎病患儿并发冠状动脉损害的危险因素(P<0.05)。详见表4。

表4 影响川崎病患儿并发冠状动脉损害的Logistic回归分析

3 讨 论

川崎病是一种急性发热出疹性疾病，病因复杂，具有明显的季节性、地域性和年龄特点[6]。大量研究显示，川崎病可能与感染引起的气管炎症性损伤、机体免疫失调有关[7]，自然界中存在川崎病感染源，人体一旦感染可引起体内T细胞异常活化，Th1/Th2细胞失衡，CD25、CD30等大量活化分子过度表达，产生大量炎性细胞因子，造成血管内皮和部分组织细胞损伤，导致血管局部浸润，出现全身中小血管炎性损伤，进而引发川崎病。CRP是由肝细胞合成的一种急性时相反应蛋白，在病人体内出现急性炎症时表达水平快速升高，炎症水平下降时其含量随之下降[8]。本研究结果显示，冠状动脉损害组患儿血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠状动脉无损害组和对照组，且冠状动脉无损害组高于对照组，提示川崎病可引起患儿血清CRP、WBC、PLT、ESR水平升高，且合并冠状动脉损害病人升高程度大于无冠状动脉损害患儿。川崎病患儿血液循环中含有部分免疫小复合物，可阻滞正常情况下网状内皮系统对部分聚集或黏附血小板的清除作用，导致血小板水平升高，从而引起组织胺释放量增加，造成免疫复合物沉积，产生血管内皮损伤[9]。ESR是指一定时间内红细胞的下沉距离，可在有大量炎性介质和免疫球蛋白存在的高度活化免疫系统中高表达[10]。本研究对部分血清炎症相关因子分析结果显示，冠状动脉损害组血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠状动脉无损害组和对照组，且冠状动脉无损害组高于对照组，提示IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α可能参与川崎病合并冠状动脉损害的发生发展过程。IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α是由T细胞、单核巨噬细胞等分泌的具有生物学效应的促炎介质，可诱导内皮细胞黏附，促进血小板聚集，调控组织因子表达，改变血管内皮细胞结构，引起血管内皮损伤，导致冠状动脉受到损害。

microRNA是具有高度保守性的内源非编码单链小分子RNA，与目的基因的3′非翻译区发生特异性结合，在基因转录后水平上参与调控，稳定存在于血清、血浆等组织体液中，在机体细胞增殖、凋亡及免疫炎症反应方面起重要的作用[11]。miR-145是位于人类5q32染色体上的一种microRNA，与血管平滑肌分化状态密切相关，其靶标基因KLF5可上调SM22α、SMα-MHC和SMα-actin等血管平滑肌表型分化标志基因转录水平，在多种心血管疾病发生发展过程中起关键调节作用[12]。心肌素定位于人类染色体17p11.2，含有807个氨基酸，是分化状态下血管平滑肌细胞标志性基因的重要下游调控元件，可正向调控miR-145表达，负向调控KLF5表达[13]。孔雪云等[14]研究显示，血管平滑肌细胞受到损伤时，可引起血清miR-145及心肌素水平下降，KLF5水平升高，从而促进血管平滑肌去分化，导致血管炎性损伤。Jeffrey等[15]通过对小鼠胚胎研究显示，miR-145和心肌素之间存在相互影响作用，一方面miR-145的3′非翻译区可直接与心肌素结合，通过上调血清反应因子复合物和心肌素水平，增强自身表达，促进血管平滑肌分化，减轻血管内

膜损伤程度，缓解心血管疾病；另一方面，心肌素也可通过激活miR-145表达来参与血管损伤修复过程。本研究结果显示，冠状动脉损害组患儿血清miR-145及心肌素水平低于冠状动脉无损害组和对照组，且冠状动脉无损害组低于对照组，提示miR-145及心肌素在川崎病患儿血清中低表达，且在合并冠状动脉损害组患儿血清中的表达水平低于冠状动脉无损害组。相关性分析显示，miR-145在川崎病患儿血清中表达水平与心肌素水平呈正相关，在冠状动脉损害组中相关系数为0.847，在冠状动脉无损害组中相关系数为0.792，提示miR-145和心肌素可能通过某种机制共同参与川崎病合并冠状动脉损害的发生发展。进一步分析显示，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患儿并发冠状动脉损害的危险因素，提示可通过检测川崎病患儿血清miR-145、心肌素水平来预测冠状动脉损害的发生。

综上所述，miR-145、心肌素在川崎病合并冠状动脉患儿血清中低表达，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患儿并发冠状动脉损害的危险因素。本研究不足之处在于未对血清miR-145、心肌素水平预测冠状动脉损害的灵敏度及特异性进行进一步分析，因此，在后续研究中将会逐步涉及。