PCSK9 与缺血性脑卒中关系的研究进展

冯金妹,牛争平,王建红

脑卒中是具有高发病率、致残率、致死率的疾病,全球每年有1 370 万人受脑卒中影响,导致550 万人死亡,表明全球脑卒中负担沉重[1]。在全球范围内,脑卒中仍然是2019 年第二大死亡原因、第三大致残原因[2],成为严重公共卫生问题。急性缺血性脑卒中是最常见的卒中类型,占我国脑卒中的69.6%～70.8%[3],而动脉粥样硬化是导致缺血性脑卒中的主要原因之一。有报道指出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)降低与动脉粥样硬化性心血管疾病的风险降低相关,包括心血管疾病和脑卒中[4]。PCSK9 属于分泌型丝氨酸蛋白酶家族,称为原蛋白转换酶(PCs)[5],是由1 号染色体上的PCSK9 基因编码的,在许多组织和细胞中普遍表达[6]。PCSK9 由31～152 个残基的原结构域、1～30个残基的信号肽、153～451 个残基的C 末端结构域和153～451 个残基的催化区组成[7]。PCSK9 与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,导致其在细胞内降解,从而降低受体的活性,促进血清LDL-C 水平升高[8]。PCSK9 与缺血性脑卒中存在一定的相关性,并可能通过独立于LDL-C 之外的途径调节缺血性脑卒中的发生发展。

1 PCSK9 与动脉粥样硬化

1.1 PCSK9 在血脂稳态中的作用 高水平的血清LDL-C 与心脑血管疾病,特别是缺血性脑卒中的风险相关。研究发现,成熟PCSK9 的主要作用是降低LDLR 在肝脏或周围组织中的表达水平,从而间接阻止肝细胞和组织对LDL-C 的摄取[9]。成熟的PCSK9在蛋白质合成后,介导了未成熟的LDLR 从内质网到高尔基膜的运输,也可与成熟的LDLR 结合,并通过网状蛋白轻链/溶酶体的激活诱导其降解[10]。LDLR 聚集在肝细胞表面包被网状蛋白的凹坑中,在与LDL-C结合后,产生一个内吞囊泡[11]。在囊泡中,LDLR 可以通过构象变化导致低密度脂蛋白颗粒释放,LDLR 被循环回到肝细胞表面,从循环中提取更多的LDL-C,低密度脂蛋白颗粒运送到溶酶体被降解[11]。PCSK9 由肝细胞分泌,与LDLR 的表皮生长因子样重复A 结构域(EGF-A)结合,当PCSK9-LDLR 复合体内化时,PCSK9 的存在阻止了LDLR 的构象变化[12]。有研究认为环化酶相关蛋白-1(CAP-1)是PCSK9 降解LDLR所必需的,PCSK9 能够与CAP-1 相互作用,导致蛋白复合物LDLR/PCSK9/CAP-1 通过一种小窝蛋白依赖机制进入溶酶体降解,细胞表面的LDLR 减少,对LDL-C 清除能力下降[13]。

PCSK9 主要在肝脏表达,但也在肝外组织(如肠、肾脏和血管)表达。PCSK9 由肾脏和血管分泌进入循环,下调包括肝细胞和巨噬细胞在内的其他细胞的LDLR 水平,从而降低这些细胞对LDL-C 摄取[14]。在肠道中,PCSK9 主要通过减少血清LDL-C 的分泌而不是摄取来上调胆固醇水平[15]。基于这些机制,使LDL-C在血浆中积聚,导致动脉粥样硬化的发展。越来越多的研究表明,PCSK9 对血脂和动脉粥样硬化的影响涉及的机制超出了对LDL-C 清除的调节。PCSK9 不仅能够影响细胞LDLR 水平和对LDL-C 的摄取,还可与其他受体相互作用,如LDLR 相关蛋白1(LRP1)、载脂蛋白E 受体2(ApoER2)和CD36 等[16],其对胆固醇稳态的贡献尚不清楚,可能与富含三酰甘油的脂蛋白代谢有关[17]。PCSK9 不仅通过减少肝脏脂蛋白清除,还通过促进肝脏脂肪生成来影响血脂和脂蛋白水平[18]。

1.2 PCSK9 在线粒体功能障碍中的作用 线粒体是参与诱导氧化应激的主要细胞成分。既往研究证实,过量的线粒体源性活性氧(mtROS)可诱导DNA、RNA、蛋白质和脂质过氧化损伤,导致线粒体功能障碍,从而促进动脉粥样硬化的发展[19]。Ding 等[20]发现,用siRNA 敲除PCSK9 可抑制平滑肌细胞和内皮细胞中mtROS 的产生且PCSK9 以近线性的剂量依赖方式增加mtROS 的生成和mtDNA 损伤。这些作用共同促进细胞损伤,从而导致动脉粥样硬化。

1.3 PCSK9 在细胞凋亡中的作用 血管内皮细胞和巨噬细胞的凋亡是动脉粥样硬化的标志,内皮细胞过度凋亡改变了内皮的完整性,增加了通透性,从而促进了内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发生[21]。PCSK9通过Bcl-2/Bax-Caspase9-Caspase3 线粒体通路和p38/c-Jun 氨基端激酶(JNK)-有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导内皮细胞凋亡,改变内皮完整性,最终促进内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发生发展[15]。有研究发现细胞凋亡与PCSK9 在血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达有关。通过检测Caspace-3、Bax 和Bcl-2 的表达,重组PCSK9 作用于VSMCs 会增加细胞凋亡,作为PCSK9 直接促凋亡作用的证据,用合成的PCSK9 抑制剂Pep2-8 作用于VSMCs 可减弱这一过程,提示存在因果关系[22]。

2 PCSK9 与炎症

近年来,研究发现炎症也是导致缺血性脑卒中的危险因素,治疗炎症可以降低缺血性脑卒中风险[23]。多区域正电子发射断层-磁共振成像研究表明,亚临床动脉粥样硬化的中年个体存在动脉炎症,提示动脉粥样硬化早期存在炎症状态[24]。一些临床试验表明,循环中的PCSK9 水平可以作为无症状成年人颈动脉粥样硬化的预测因子,并可能与颈动脉粥样硬化的进展有关[25-26]。研究发现,全身炎症反应综合征和败血症病人血清PCSK9 水平升高[27],肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内毒素可促进血管内皮细胞PCSK9 的表达[22]。PCSK9 的血清水平与促炎因子[白细胞介素(IL)-6、IL-1β、TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)及超敏C 反应蛋白(hs-CRP)]之间存在显着相关性[22],提示促炎环境增强PCSK9 的表达和释放。PCSK9 本身也可增强炎症。Tavori 等[28]发现脂多糖(LPS)处理后的PCSK9 基因缺失小鼠血清IL-1β水平显着降低。重组PCSK9 能够促进LPS 刺激巨噬细胞中促炎因子TNF-α和IL-1β 的 转 录,并 抑 制 抗 炎 因 子 mRNA 水 平。PCSK9 主要通过刺激炎性细胞因子的分泌、介导清道夫受体表达调控及诱导单核细胞迁移能力增强等机制促进炎症的发展[15]。Tang 等[29]发现PCSK9 在动脉粥样硬化斑块中的表达水平增加,PCSK9 基因沉默的小鼠主动脉粥样硬化斑块较野生型少,以及病变中血管炎症调节因子如IL-1β、TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、Toll 样受体4(TLR4)和核转录因子-κB(NF-κB)的表达减少,表明PCSK9 似乎通过TLR4/NF-κB 信号通路加重血管炎症而发挥炎症介质的作用。有研究报道,用PCSK9 处理的巨噬细胞中,清道夫受体A(SR-A)、CD36 和凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)的水平以及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)摄取增加[30]。与PCSK9+/+细胞相比,PCSK9-/-小鼠平滑肌细胞的增殖和迁移能力较低[31]。Giunzioni 等[32]发现PCSK9在动脉粥样硬化病变中逐渐积聚,导致炎性单核细胞的浸润比对照组增加32%,从而促进炎症的发展。

3 PCSK9 与血栓形成

血栓形成是缺血性脑卒中的主要病理过程,血小板活化、在血管损伤部位的聚集以及随后血栓闭塞是动脉血栓性疾病的关键步骤[33]。最近的研究表明,PCSK9 可能也会影响止血系统[34]。Magwenzi 等[35]认为PCSK9 通过提高ox-LDL 水平导致血小板反应性增强,ox-LDL 通过CD36-PKC 信号通路增强烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)依赖性活性氧(ROS)的生成,促进血小板活化。而Qi 等[36]研究发现,血浆中的PCSK9 直接促进血小板激活和体内血栓形成,PCSK9 与血小板CD36 受体结合,从而激活酪氨酸蛋白激酶(Src)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)5 和JNK,增加ROS 的产生,并激活CD36 下游的p38/胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)/环氧酶-1(COX-1)/血栓素A2(TXA2)信号通路,从而促进血小板激活,PCSK9 抑制剂或阿司匹林可消除PCSK9 对血小板激活和体内血栓形成的增强作用,预防血栓形成。该研究使用敲除CD36 的小鼠为模型发现PCSK9 对血小板活化的增强作用是CD36 依赖性的。

血小板也是PCSK9 的来源之一。血小板在激活时具有储存PCSK9 和释放储存的PCSK9 的能力,释放的PCSK9 可促进血小板聚集和血栓形成[37]。这些发现表明,循环中的血小板可能对血浆中PCSK9 的水平有影响,血小板源性PCSK9 的释放可能参与调节血浆LDL-C 水平,并可能对血栓形成和血管炎症产生影响,从而导致动脉粥样硬化及血栓形成。

4 PCSK9 与糖尿病

多项研究表明,作为一种新的胆固醇代谢调节因子,PCSK9 也可能在2 型糖尿病(T2DM)的发生发展中发挥重要作用。既往研究表明,T2DM 病人血浆PCSK9 水平较高,循环PCSK9 浓度与血糖和T2DM风险呈正相关[38],下调PCSK9 可以改善脂肪和葡萄糖代谢[39]。Hamamura 等[40]研究了日本普通人群血清PCSK9 水平与脂代谢和胰岛素抵抗的关系,认为在冠心病风险相对较低的日本人群中,高血清PCSK9 水平与血清三酰甘油和脂蛋白(a)水平以及胰岛素抵抗有关。Shi 等[41]在以人群为基础的队列研究中发现在糖尿病前期女性受试者中,循环PCSK9 水平与发生2型糖尿病的风险呈正相关,在糖尿病前期男性受试者中没有观察到明显的相关性。Momtazi-Borojeni 等[42]认为通过脂质体IFPT 疫苗抑制PCSK9 可以改善糖尿病病人的血糖、胰岛素抵抗以及血脂谱。但亦有研究认为血浆PCSK9 水平与新发糖尿病风险无相关性[43]。目前关于PCSK9 和糖尿病之间的关系还没有普遍的共识。

5 PCSK9 与其他脑血管病危险因素

PCSK9 除了影响脂蛋白的合成过程和促进动脉粥样硬化的特性外,还在葡萄糖代谢、血压调节、脂肪生成、血管舒缩功能等方面发挥作用[42,44]。PCSK9 可以通过促进肾小管上皮细胞的Na+通道降解,有助于血压调节,有研究表明PCSK9 缺乏和PCSK9 抑制剂不会导致血压的显着变化,PCSK9 对血压调节的影响似乎可以忽略不计[45]。有研究发现,在女性中,循环PCSK9 与高三酰甘油、高血压和代谢综合征呈正相关[46]。这表明循环PCSK9 升高与脑卒中危险因素显着相关。一项研究报道,在使用PCSK9 抑制剂进行短期治疗后,颈动脉-股动脉脉搏波速度有了显着改善,这一结果是在LDL-C 升高的情况下实现的[44],提示PCSK9 可能通过独立于LDL-C 之外的途径对缺血性脑卒中多种危险因素产生影响。

6 PCSK9 抑制剂与脑卒中

PCSK9 抑制剂是一种新型的降脂药物,通过与PCSK9 分子结合来减少LDLR 的降解。最近的研究表明,PCSK9 抑制剂可以降低高达60%的LDL-C 水平,并预防心脑血管事件[47]。降低PCSK9 的方法包括减少PCSK9 基因表达的小干扰RNA 和反义寡核苷酸,阻止PCSK9-LDLR 复合体形成的单克隆抗体,以及阻碍PCSK9 与LDLR 相互作用的高亲和力模拟肽或合成蛋白[48]。

FOURIER 试验是第一个成功完成的PCSK9 抑制剂的心脑血管结局试验,共有27 564 例动脉粥样硬化性心脑血管疾病病人(特别是有心肌梗死、缺血性脑卒中或有症状的外周动脉疾病的病人)参加,与安慰剂组相比,PCSK9 抑制剂依洛尤单抗治疗显着降低了主要终点(定义为心血管死亡、心肌梗死、脑卒中、冠状动脉血运重建或因不稳定心绞痛住院)的风险和次要终点(心血管死亡、心肌梗死或脑卒中的综合结果)的风险[49]。奥德赛试验表明,PCSK9 抑制剂阿利西尤单抗与缺血性心脑血管事件的显着减少有关[50]。一项包括ODYSSEY 结果和FOURIER 结果的荟萃分析得出结论,与安慰剂相比,PCSK9 抑制剂与脑卒中的相对风险降低相关。这种效果不受既往脑卒中史或基线LDL-C 水平的影响[51]。Qin 等[52]研究显示,PCSK9 抑制剂使脑卒中的相对危险度(RR)降低23%,使缺血性脑卒中的RR降低24%,表明PCSK9 抑制剂与缺血性脑卒中相关,可有效降低缺血性脑卒中的发生率,且不增加出血性脑卒中和神经认知障碍的风险,安全性较好。

7 小结与展望

PCSK9 不仅通过增加肝脏表面LDLR 的降解,在调节胆固醇稳态方面发挥着重要作用,且通过LDLR以外的其他机制调节缺血性脑卒中的发生发展,在动脉粥样硬化、炎症、血栓形成、葡萄糖代谢等方面发挥重要作用。有研究表明,PCSK9 在血压调节、脂肪生成、血管舒缩功能等方面有不同的作用,因此,有关PCSK9 在缺血性脑卒中产生的作用及其机制仍有待深入研究。PCSK9 作为降脂治疗的新靶点目前受到广泛的关注,PCSK9 抑制剂有效降低了未来发生包括缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作在内的心脑血管事件的风险,具有良好的安全性,可能是预防缺血性脑卒中的一种很好的策略和方法。