尹佳琦，卢 军，刘佰林，马小强
缺血性脑血管病(ischemia cerebral vascular disease，ICVD)指由于相应脑组织的缺血、缺氧而引起的短暂或持续、局部或弥漫性的脑组织损伤，导致一系列神经功能障碍症状或体征的脑血管病的总称[1-6]。而脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是缺血性脑血管病的重要病理过程。血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是脑组织和脑循环之间的生理屏障，滋养脑组织，过滤从大脑到血液的各种物质，保护中枢神经系统的稳定，而CIRI早期可损伤血脑屏障，降低CIRI导致的血脑屏障损伤，对于CIRI的治疗有着重大意义[7-8]。本研究观察活血通络方对大鼠脑缺血再灌注后脑组织紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、水通道蛋白4(AQP4)含量的影响，从调节血脑屏障结构和功能方向探讨活血通络方改善CIRI的可能调节机制及潜在作用靶点。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂 DR-200Bs酶标仪(Diatek公司)；DYY-6C电泳仪、DYCZ-400D转移电泳仪槽(北京市六一仪器厂)；TGL-16c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Eclipse Ci-L正置荧光拍照显微镜(Nikon)；UPK-1-10T超纯水机(UPK-1-10T)；RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；WD-9405脱色摇床(北京市六一仪器厂)；移液枪(Dragon)；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒(货号：AS1086)；增强型化学发光试剂(ECL)化学发光检测试剂盒(货号：AS1059)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(货号：IPVH00010)；MicroPublisher成像系统(Q-IMAGING)；ZO-1(货号：sc-33725)；闭合蛋白(货号：ab167161)；MMP-2(货号：ab86607)；AQP4(货号：16473-1-AP)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(货号：AS-1107)；HRP标记山羊抗小鼠GAPDH(货号：AS-1106)。
1.2 实验药物 活血通络方由怀牛膝、石决明、天麻、钩藤、龙齿、白芍、黄芪、太子参、丹参、玄参等药物组成。
1.3 实验动物 清洁SD雄性大鼠50只，体质量180～220 g，许可证号：SCXK(新)2003-0001，由新疆实验动物中心提供。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组，每组10只。假手术组和模型组连续2周给予生理盐水10 mg/(kg·d)灌胃；阳性对照组给予尼莫地平混悬液9.375 mg/(kg·d)灌胃，连续2周；活血通络方低剂量组给予活血通络方水体液6.25 g/(kg·d)灌胃，连续2周；活血通络方高剂量组给予活血通络方水体液25 g/(kg·d)灌胃，连续2周。
1.4.2 动物模型制备 用水合氯醛400 mg/kg腹膜内注射麻醉大鼠，颈部正中切开表皮，暴露右侧颈总动脉，小心地暴露颈外动脉和颈内动脉，并将其与邻近的神经分开。将尼龙丝引入动脉切开孔，向远端送入颈内动脉，并从颈动脉分叉处推进18～20 mm。缺血2 h后，轻轻取出尼龙丝。假手术组进行相同的麻醉和创口缝合，但不闭塞脑中动脉。所有动物均由同一操作员在相同条件下操作。
1.4.3 神经功能评分 采用 Zea-Longa 评分法进行评分，具体评分标准详见表1。
表1 Zea-Longa神经功能损伤评分表
1.4.4 蛋白免疫印迹法 配制10 %分离胶，加水封30 min，注意胶中不能有气泡，胶已凝固，吸弃水封，加入4%的浓缩胶，立即插入样品梳。电泳80 V 30 min后转为120 V 40 min。 将切好的 PVDF膜置于甲醇溶液中浸泡，然后与胶置于夹子中后放入转移槽中。外敷冰降温。120 V转膜2 h。移至 4 %脱脂奶粉封闭液，室温封闭1 h。分别加入上述指标一抗(1∶1 000)孵育过夜，同时以 GAPDH 作为内参照。TBST洗涤液洗膜，室温 10 min，重复3次。孵育二抗，室温 1 h，TBST洗涤液洗膜，室温 10 min，重复3次；ECL发光液进行化学发光反应。
1.4.5 免疫组化 抗原修复，磷酸缓冲盐溶液(PBS)浸泡 5 min，3%过氧化氢孵育15～20 min；添加试剂血清封闭 20 min 后去血清，用一抗孵育，37 ℃、4 ℃过夜；PBS洗涤3 min，重复3次；室温下用二抗孵育20 min；PBS洗涤3次，每次3 min；室温下试剂 C孵育20 min；PBS洗涤3 min，重复3次；用显色剂显色；自来水冲洗后用中性树胶封片。
2 结 果
2.1 各组大鼠神经功能评分比较 与假手术组比较，模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组神经功能评分均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组神经功能评分均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与活血通络方低剂量组比较，活血通络方高剂量组和阳性对照组神经功能评分均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；活血通络方高剂量组与阳性对照组神经功能评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。
表2 各组大鼠神经功能评分比较(±s) 单位：分
2.2 各组大鼠脑组织ZO-1蛋白和闭合蛋白表达比较 与假手术组相比，模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，活血通络方高剂量组、活血通络方低剂量组及阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与活血通络方低剂量组相比，活血通络方高剂量组与阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；活血通络方高剂量组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1及表3。
图1 各组大鼠脑组织ZO-1蛋白和闭合蛋白表达条带图
表3 各组大鼠脑组织ZO-1蛋白和闭合蛋白表达比较(±s)
2.3 各组大鼠脑组织MMP-2、AQP4表达比较 与假手术组相比，模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组MMP-2、AQP4表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，活血通络方高剂量组、活血通络方低剂量组及阳性对照组MMP-2、AQP4表达水平均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；与活血通络方低剂量组相比，活血通络方高剂量组与阳性对照组MMP-2、AQP4表达水平均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；活血通络方高剂量组MMP-2、AQP4表达水平与阳性对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。
表4 各组大鼠脑组织MMP-2、AQP4表达比较(±s)
3 讨 论
脑缺血再灌注会引起脑损伤，导致脑水肿、脑出血和神经元死亡，包括兴奋性氨基酸毒性、能量代谢障碍、细胞内钙超载、炎症反应、细胞凋亡等多种机制，是一个复杂的病理过程[9]。
血脑屏障破坏可导致离子失调、水肿和神经炎症，从而导致神经元功能障碍、颅内压升高和神经元变性，是CIRI的重要病理阶段[10]。血脑屏障功能障碍通常与脑水肿有关，严重时甚至导致脑出血，这是CIRI后脑水肿重要的病理改变[11]。因此，改善CIRI导致的血脑屏障损伤，对缺血性脑血管疾病的治疗有着重大意义。本研究探讨活血通络方对CIRI大鼠保护作用的影响，从对血脑屏障结构和功能的调节作用研究活血通络方对CIRI影响的可能机制。
紧密连接由多个蛋白组成的细胞黏附，这些蛋白通过其细胞外成分直接相互作用，将两个细胞膜连接在一起，包括跨膜蛋白(闭合蛋白、紧密连接蛋白、连接黏附分子)、胞质附着蛋白[ZO-1、紧密连接蛋白2(ZO-2)和紧密连接蛋白3(ZO-3)]和细胞骨架蛋白等组成部分。CIRI中紧密连接位置的异常、表达数量对血脑屏障通透性及神经功能影响重大[12]。有研究通过观察脑CIRI大鼠模型血脑屏障通透性及ZO-1、 闭合蛋白与紧密连接蛋白5的异常表达和分布发现，CIRI可能导致紧密连接蛋白的结构和功能的变化，从而导致血脑屏障通透性异常[13]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组、活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显降低(P<0.05)；与模型组相比，活血通络方低剂量组、活血通络方高剂量组、阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与活血通络方低剂量组相比，活血通络方高剂量组与阳性对照组ZO-1蛋白和闭合蛋白表达均明显减少(P<0.05)，表明活血通络方可能通过上调ZO-1和闭合蛋白的表达，加强细胞间的连接，从而保持血脑屏障的稳定性，避免CIRI后导致的脑组织的二次损伤。
CIRI可以激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，MMPs 是一组可以降解多种细胞外基质成分的锌依赖的蛋白水解酶，在组织形态发生、细胞迁移和血管生成等过程中发挥作用，参与大脑和血脑屏障的许多生理和病理过程[14-16]。有研究发现，MMP-2的活性受到抑制后可阻碍细胞外基质(ECM)的降解，从而导致细胞外胶原纤维的聚集[17]。CIRI中发现血脑屏障和紧密连接蛋白的破坏，而抑制MMPs可以防止紧密连接蛋白的丢失，表明MMPs通过降解紧密连接蛋白来破坏屏障的完整性[18]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组及各用药组MMP-2水平均明显升高；而与模型组相比，各用药组MMP-2水平均明显降低；与活血通络方低剂量组相比，活血通络方高剂量组与阳性对照组MMP-2水平均明显降低，表明活血通络方可能通过下调MMP-2表达水平，降低对紧密连接蛋白等基质蛋白的降解，保护血脑屏障的功能。
AQP4广泛存在于中枢神经系统内，具有不同于其他水通道蛋白的特征，是药物发现的有吸引力的靶标，与脑水肿的发生密切相关，AQP4在神经胶质细胞中表达，在主要血管和脑组织之间的边界高表达，参与维持脑稳态，并可能是调节渗透压的关键因素[19-20]，当 AQP4异常表达时，血脑屏障通透性会发生明显改变，导致脑水肿的发生[21-24]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组及各用药组AQP4水平均明显升高；与模型组相比，各用药组AQP4水平均明显降低；与活血通络方低剂量组相比，活血通络方高剂量组与阳性对照组AQP4水平均明显降低。表明活血通络方可能通过下调AQP4表达水平，抑制脑水肿的发展，保护血脑屏障的功能。
综上所述，活血通络方可改善大鼠CIRI，其机制可能是通过上调ZO-1、闭合蛋白和下调MMP-2、AQP4，从而调节血脑屏障结构和功能，发挥神经保护作用。
