基于多基因SNP的LASSO回归模型预测高危人群缺血性脑卒中发生风险的价值

田 齐,贾海莉,庞永鹏,赵 刚,陈玺龙

缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是目前国内导致中老年人群死亡的重要因素之一,针对高危人群进行早期预防性干预能有效降低IS的发生率,避免严重后果的发生[1-2]。而目前针对IS高危人群的相关预测研究较多,但由于既往构建的模型指标质量差异,导致预测质量参差不齐[3]。伴随着基因研究的深入,对于IS疾病基因层面的研究使其临床检测指标的特异性明显提升。Li等[4]的研究显示,CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)等基因位点中的不同表达与IS病人各类指标显着相关,故本研究在其基础上针对性建立IS预测模型,旨在为临床诊断及治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年7月—2019年12月于我院就诊并明确存在颈动脉粥样硬化且改良的弗明汉卒中量表评分≥15分的病人350例作为研究对象。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准:①经影像学检查明确存在颈动脉粥样硬化;②年龄>18岁,具有独立意识,能完成随访;③改良的弗明汉卒中量表评分≥15分;④病人及家属知情同意。排除标准:①既往IS病史;②合并其他严重的慢性疾病,预计生存期无法完成随访;③合并其他脑血管疾病;④长期使用免疫抑制剂、细胞毒类药物且无法暂停治疗;⑤半年内严重感染疾病病史。符合上述要求并上报医院伦理委员会审核通过后纳入研究。

1.3 方法

1.3.1 仪器及试剂 DNA提取试剂(DNAzolTMBD,赛默飞世尔公司生产);逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)Kit mRNA定量检测试剂盒(SYBR PrimeScriptTM,日本TaKaRa公司提供);定量聚合酶链式反应(PCR)仪及ABI377全自动DNA测序仪(Applied Biosystems ABI7500型,美国Biolytic公司提供);探针和引物的设计由北京三搏远志生物完成。

1.3.2 各基因位点表达测定 所有病人于纳入研究后次日清晨抽取空腹静脉血,并提取样本内DNA后进行PCR扩增。扩增完成后取4 μL产物与缓冲液、浓度为2 μmol/L的混合探针各1 μL及Taq酶2 U混合成总量为10 μL的反应体系进行连接反应(反应体系总量不足用双蒸水补足),而后使用测序仪对产物进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)基因型及等位基因的分型检测,使用SDS2软件进行分析。扩增程序:预变性(95 ℃,2 min)、变性(94 ℃,30 s)、退火(65 ℃,30 s)、延伸(65 ℃,30 s),进行40个循环后再次延伸(65 ℃,10 min)。连接反应程序:预变性(95 ℃,2 min)、变性(94 ℃,15 s)、延伸(50 ℃,25 s),共40个循环。PCR引物及连接反应探针和Taq酶序列见详表1、表2。

表1 各基因PCR引物序列

表2 连接反应探针和Taq酶序列

1.3.3 随访方法及IS诊断标准 所有病人纳入研究后,每周由研究组医生进行电话随访,病人每个月定时到我院门诊进行相关检查,随访时间为2年。参照《中国急性缺血性脑卒中早期血管内介入诊疗指南2018》[5]相关标准对IS进行诊断,在随访期间统计IS发生例数及时间。

1.4 观察指标

1.4.1 一般资料 包括:年龄、性别、体质指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、家族史、药物使用史[包括钙离子拮抗剂(CCB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、他汀类药物、降糖类药物、胰岛素]、血压。

1.4.2 实验室及影像学资料 包括:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血肌酐(Cr)、同型半胱氨酸(Hcy)、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、颈部斑块不稳定、合并冠心病。

1.4.3 多基因SNP情况 包括CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)SNP表达及分布频率情况。

2 结 果

2.1 病人随访结果、分组及一般资料比较 随访结束,共332例病人完成随访,完成随访率为94.86%。其中发生IS 103例,发生率为31.02%。将332例病人分为IS组(103例)和非IS组(229例),IS组吸烟史、饮酒史、收缩压高于非IS组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组病人一般资料比较

2.2 两组病人实验室及影像学检查资料比较 IS组病人Hcy、Glu、TC、颈部斑块不稳定占比及合并冠心病占比明显高于非IS组,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Hardy-Weinberg平衡验证,各组基因频率均符合遗传平衡法则(P>0.05);IS组病人CD137基因(rs161827)CC型占比及等位基因C分布频率、RNLS基因(rs10887800)AA型占比及等位基因A分布频率、ALOX5AP基因(rs4073259)TT型占比及等位基因T分布频率高于非IS组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、表5。

表4 两组病人实验室检查资料及影像学检查资料比较

表5 两组病人IS关键基因SNP情况比较

2.3 风险预测因子的选择及预测模型的构建 以是否发生IS为因变量,共纳入11个自变量。由于不同自变量之间可能存在相关性,故对数据进行降维,并筛选出最具代表性的IS发生预测因子,对所有自变量进行LASSO回归分析,由图1可知,随着惩罚系数λ的变化,模型初始纳入的自变量的系数被逐步压缩,最后为0。为寻找最佳惩罚系数 λ、使模型性能优良且影响因素最少,选择十折交叉验证法中误差最小λ+1(0.094)作为最优值。最终筛选出Hcy、Glu、TC、收缩压、饮酒史、颈部斑块不稳定、CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)9个预测IS的自变量(见图2)。

图1 纳入LASSO回归的11个临床特征的系数曲线

图2 经LASSO回归、十折交叉验证法选择最合适的临床特征

2.4 影响IS相关因素的Cox回归分析 根据单因素分析结果,以是否发生IS及IS发生时间为因变量,以LASSO回归分析9个临床特征结果作为自变量进行Cox回归分析,结果显示,Hcy、Glu、TC、饮酒史、颈部斑块不稳定、CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)是IS的影响因素(P<0.05)。详见表6。

表6 IS影响因素的Cox回归分析

2.5 综合模型预测IS发生的ROC曲线 根据Cox回归分析结果,建立预测模型并构建分析ROC曲线,结果显示,模型对于IS发生预测的敏感度74.75%,特异度为87.55%,具有较好的预测价值[AUC=0.901,95%CI(0.864,0.936),P<0.05]。详见图3。

图3 综合模型对IS发生预测的ROC曲线

3 讨 论

IS的主要病理改变为栓子或血栓阻塞脑动脉而导致的血流量和供氧减少,识别与IS发生相关的基因和分子对于了解和控制该疾病具有重要意义[6-7]。由于具有大量遗传成分,IS 的遗传力范围为16%～40%,相关研究已揭示了属于不同基因的几种变异对 IS 及其特定亚型的贡献作用[8]。同时,IS属于多因素疾病,其病理机制涉及多种成分,包括众多环境和遗传风险因素,故通过联合基因检测指标对于提升IS的预测效能具有较为实用的临床价值[9-10]。

在本研究中,所有病人随访2年内的IS发生率为31.02%,高于国内外指南中IS的发病率[11],主要原因可能是由于本研究选取的病例全部为存在颈动脉粥样硬化的高危病人,此类病人因为斑块可能发生脱落,所以IS发生率远高于正常人。一般资料显示,具有吸烟史及饮酒史的病人IS发生率较高,首先,烟草及酒精与心血管疾病的发生显着相关,尤其是对于具有IS高风险因素的病人,烟草及酒精戒断是公认的有效预防措施,故此二项对于IS发生具有一定的影响[2,12]。两组收缩压存在明显差异,通过血液流动特点可以得出,收缩压较高对于血管内斑块的冲击力相对较强,而收缩压较高时,斑块不稳定甚至脱落的风险高于低收缩压及舒张压时,故IS病人收缩压相对较高[13]。

Hcy是介导体内甲硫氨酸和半胱氨酸分解及代谢的重要影响因素,而高水平Hcy可引起凝血功能异常升高及心脑血管平滑肌细胞过度增殖、增强体内氧化反应导致血管内皮损伤,从而引起血管内皮功能发生障碍,诱发脑血管动脉粥样硬化,最终导致IS的发生[14]。而本研究所纳入病人均为颈动脉粥样硬化斑块病人,其Hcy值本就高于正常人,而过高的Hcy水平会导致粥样硬化的进一步加重,从而导致IS的发生[15-16]。Glu对于循环系统具有显着影响,研究显示,Glu升高会在导致血管内皮损伤的同时诱发神经损伤,二者在各自进展的同时还存在相互影响的作用,可导致两个系统损伤由周围末梢向中央关键部位的进展[3]。TC是构成粥样硬化斑块的重要成分,同时,过高的TC会导致血液流变情况迟缓,从而导致局部血流情况变差,这是导致IS的重要影响因素,而本研究中IS病人TC明显升高,说明TC对于IS的发生可能具有一定的影响,这与Carson等[17]的研究相似。在影像学表现中,斑块不稳定及冠心病病人IS发生率升高,斑块不稳定脱落形成血栓是IS发生的重要机制之一,而颈动脉粥样硬化合并冠心病病人形成血栓的概率更高,尤其是冠心病会导致心肌功能损伤,从而影响心房、心室的功能,最终影响血流状态,进一步提升IS的发生风险[18-19]。CD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员,研究表明,CD137/CD137L相互作用可能会激活核转录因子-κB(NF-κB)的分泌和提高白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的转录[20]。而Ye等[21]的研究提示,TNF-α和IL-6在影响血管紧张素Ⅱ调节血压作用中发挥重要作用,其中rs161827的显性基因已经被证实对于收缩压具有显着的影响,且并不排除其通过其他途径对IS产生进一步影响。RNLS是一种由肾脏分泌的单胺氧化酶,参与循环儿茶酚胺的氧化降解,研究表明,RNLS(rs10887800)可能是通过介导血糖代谢从而导致IS的发生[22]。ALOX5AP基因是5-脂氧合酶激活蛋白的编码基因,研究显示,rs4073259位点在普通人群中多处于沉睡状态,当基因发生突变导致其显性表达时,可以通过激活白三烯等炎性因子表达途径引起血管内皮损伤进而导致IS的发生[23]。而本研究结果显示,IS病人上述3个基因显性表达占比高于非IS病人,与上述研究结果类似。

通过LASSO筛选使预测模型更具有可读性,并建立Cox模型分析上述因素预测IS的发生风险,AUC为0.901[95%CI(0.864,0.936)],说明本研究构建的预测模型具有较好的临床应用价值。

综上所述,基于多基因SNP的LASSO回归模型对高危人群2年内发生IS的风险预测具有一定的临床价值,但是本研究为单中心、小样本研究,需要进一步扩大样本量并增加不同影响因素进行验证;同时本研究由于时间限制随访期较短,需要进一步延长随访时间来证实本研究结果。