恒清Ⅴ号方对戊四唑诱导癫痫模型小鼠癫痫发作及神经细胞变性损伤的作用机制

邓楚珺,孟胜喜,陈慧泽

癫痫(elilepsy,EP)是以反复性、发作性、短暂性、刻板性的中枢神经系统功能失常为特征的脑部神经元高度同步化且常具自限性的异常放电所导致的综合征。由于异常放电神经元的位置不同,放电和扩散的范围不等,病人发作可表现为感觉、运动、意识、精神、行为、自主神经功能障碍或兼而有之[1-2]。目前,全球约有7 000万例以上的癫痫病人[3],我国约有900万例以上的癫痫病人,其中活动性癫痫病人有500万～600万例,同时每年新发癫痫病人65万～70万例[4]。恒清Ⅴ号方是本课题组经过长期临床实践总结、归纳和验证研发的治疗癫痫中药经验复方。基于前期研究成果,本实验验证中药复方恒清Ⅴ号方的抗癫痫作用,并进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器

XY-1B系列精密电子天平(上海奕宇电子科技有限公司);5811型低温高速离心机(Eppen-dorf公司);Epoch酶标仪(BioTek公司);超微量紫外可见分光光度计(Thermo Scientific公司);正置荧光显微镜[尼康仪器(上海)有限公司]。

1.1.2 药物与试剂

丙戊酸钠缓释片[商品名:德巴金,生产企业:赛诺菲(杭州)制药有限公司,规格:500 g×30片,国药准字H20010595,lot:BHG0357)];戊四唑(pentylenetetrazole,PTZ,上海源叶生物科技有限公司,lot:S48261);谷氨酸(Glu)试剂盒(lot:A089-1-1)和谷氨酰胺合成酶(GS)测定试剂盒(lot:A089-1-1),均购自南京建成生物工程研究所。超敏C反应蛋白(hs-CRP)、热休克蛋白70(HSP-70)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海初态生物科技有限公司。GFAP、Fos抗体及免疫组织化学试剂盒,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。恒清Ⅴ号方组方:胆南星15 g,僵蚕10 g,全蝎2 g,石菖蒲15 g,蝉蜕10 g,川芎15 g。由上海交通大学附属第六人民医院中药房提供。按处方比例称取以上中药药材,加10倍量水,浸泡0.5 h,煎煮3次,每次40 min,过滤,合并以上3次滤液,37 ℃水浴加热浓缩,根据临床实际用药情况对药液进行浓缩处理,并以中质量浓度匹配临床的实际用药浓度。中质量浓度浓缩至0.535 g/mL,恒清Ⅴ号方低剂量为0.267 g/mL,恒清Ⅴ号方中剂量为0.535 g/mL,恒清Ⅴ号方高剂量为1.070 g/mL,分别置于4 ℃冰箱贮存备用。

1.1.3 实验动物

无特定病原体(SPF)级,雄性C57BL/6J小鼠110只,体质量(23±3)g,购自上海灵畅生物科技有限公司,动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-003。饲养于上海吉凯基因化学技术有限公司动物房,全部动物预饲养2周,分别单笼喂养。光照/黑暗:12 h/12 h,随意饮水和进食,温度(22±2)℃,相对湿度(60±5)%。

1.2 方法

1.2.1 癫痫小鼠模型的建立

采用戊四唑(PTZ)点燃、的方法制备癫痫小鼠模型[5]。将112只C57BL/6J小鼠随机分为正常组(18只)和造模组(94只)。造模组以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每2 d 1次。根据Racine分级表评估小鼠的癫痫发作级别[6](见表1)。连续3次注射戊四唑后,小鼠癫痫发作为4级或5级,提示为点燃成功。共点燃造模成功90只小鼠,将90只小鼠随机分为模型组、恒清Ⅴ号方低剂量组、中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组,每组18只。

表1 Racine分级

1.2.2 给药

丙戊酸钠组给予丙戊酸钠缓释片溶液(丙戊酸钠缓释片加入生理盐水中配制而成)灌胃,恒清Ⅴ号方低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予0.267、0.535、1.070 g/mL剂量的恒清Ⅴ号方灌胃,均为每日 2次。丙戊酸钠缓释片溶液浓度或恒清Ⅴ号方给药浓度依据人和动物体表面积折算系数进行换算[7],计算结果为14.8 g/kg。正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日2次,各组均持续灌胃30 d。在灌胃给药的过程中,除正常组外,其他各组继续以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每5 d 1次。

1.2.3 癫痫发作级别与发作潜伏期

分别于治疗后10 d、治疗后20 d、治疗后30 d时,观察小鼠的癫痫发作级别和发作潜伏期。观察方法:注射戊四唑后把小鼠放入透明箱中,连续观察30 min,记录小鼠的癫痫发作级别和癫痫发作潜伏期。癫痫发作潜伏期记录为戊四唑注射完成后到2级发作的时间,若30 min内未发作,则潜伏期记为1 800 s;同时记录最高癫痫发作级别。

1.2.4 血清hs-CRP和HSP-70水平

分别于治疗前1 d、治疗后30 d,将各组小鼠麻醉后,尾静脉取血,离心后取其上清液,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.2.5 Fluoro-Jade B(FJB)染色检测海马神经元损伤

治疗30 d后,每组小鼠中随机选取6只,然后麻醉、多聚甲醛灌注、取脑、固定、切片、脱蜡、水洗、加入FJB绿色荧光探针、DAPI染核、冲洗、吹干、透明、封片、切片,待荧光显微镜观察,采集图像以Image J软件计数FJB阳性神经元数量。

1.2.6 大脑皮层及海马Glu含量等水平

治疗30 d后,各组余下的小鼠中均随机选取6只。然后麻醉,冰上去除嗅球、小脑及低位脑干,分离大脑皮层、海马-80 ℃冰箱保存。按体质量1∶9加入提取液,4 000 r/min离心10 min,取上清于冰上待测。分别按照Glu和GS试剂盒说明书测定小鼠大脑皮层和海马中的Glu含量和GS活性。治疗30 d后,各组余下的6只小鼠,麻醉取脑分离海马组织,冲洗干净后平均分为2部分。一部分用多聚甲醛固定石蜡包埋、切片、烤片等。采用GFAP、Fos抗体及免疫组织化学试剂盒进行染色冰封片。40×倍镜下观察、拍照。参照相关标准[8]的内容进行阳性评价,并计算阳性得分,最终得分=颜色得分+阳性细胞占比得分。余下的另外一部分制备成组织匀浆,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA试剂盒检测各组小鼠海马组织中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠给药后不同时间点癫痫发作级别及癫痫发作潜伏期比较

给药10 d时,与模型组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05)。分别在给药20、30 d时,与模型组比较,各用药组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05)。详见表2、表3。

表2 各组小鼠给药后不同时间点癫痫发作级别比较 单位:级

表3 各组小鼠给药后不同时间点癫痫发作潜伏期比较 单位:s

2.2 各组小鼠给药前后血清hs-CRP、HSP-70水平比较

与给药前比较,各用药组小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05)。详见表4。

表4 各组小鼠给药前后血清hs-CRP、HSP-70水平的比较

2.3 各组小鼠给药后30 d海马组织GFAP、Fos阳性表达评分及hs-CRP、HSP-70水平比较

与模型组比较,恒清Ⅴ号方中剂量、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠海马组织GFAP和Fos阳性表达评分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠海马组织GFAP和Fos阳性表达评分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠海马组织GFAP和Fos阳性表达评分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05)。详见表5。

表5 各组给药后30 d海马组织GFAP、Fos阳性表达评分及hs-CRP、HSP-70水平比较

2.4 各组小鼠给药后30 d海马CA1区神经元变性情况比较

与正常组比较,模型组小鼠海马CA1区FJB阳性细胞数量增多(P<0.01);与模型组比较,各用药组小鼠海马CA1区FJB阳性细胞数量均减少(P<0.05或P<0.01)。与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠海马CA1区FJB阳性细胞数量减少(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠海马CA1区FJB阳性细胞数量减少(P<0.05)。详见表6。

表6 各组给药后30 d海马CA1区神经元变性情况比较 单位:个

2.5 各组小鼠给药30 d后大脑皮层、海马Glu含量及GS活性比较

与正常组比较,模型组小鼠大脑皮层和海马中的Glu含量升高,GS活性下降(P<0.01);与模型组比较,各用药组小鼠大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05)。详见表7。

表7 各组给药后30 d大脑皮层、海马Glu含量和GS活性比较

3 讨 论

癫痫在中医学中隶属于“癫疾”“痫证”等范畴,其病因与痰、火、惊、风、气关系密切,特别是以痰邪作祟为主。肝风内动、痰瘀互结是癫痫的宿根,因此,息风化痰、活血化瘀应作为本病的主要治法。

癫痫的发生与炎症机制密切相关,hs-CRP可作为癫痫的生物学标志物之一[9]。热休克蛋白(HSP)与癫痫进展有关,癫痫病人神经细胞受损后,其变性蛋白质可诱导HSP-70的生成[10],在癫痫发作时也可见到HSP-70的聚集[11]。Glu是中枢神经系统中主要神经递质,被星形胶质细胞摄取并转化成无神经元毒性的谷氨酰胺,谷氨酰胺重新被运回到神经元,可作为神经递质合成的前体物质[12],谷氨酰胺合成酶活性降低则可造成细胞外液中Glu的蓄积,从而诱发癫痫。

恒清Ⅴ号方是经过长期临床实践总结、归纳和验证的治疗癫痫疗效确切的中药经验复方,恒清Ⅴ号方全方共同起到息风化痰、定惊、活血化瘀之效,从而有效治疗癫痫。本研究结果显示,与给药10 d时比较,给药20 d时的恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均缩短(P<0.05或P<0.01);与给药20 d时比较,给药30 d时的恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均渐缩短(P<0.05或P<0.01)。给药10、20、30 d时,在相同的给药时间,与模型组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均延长(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠的癫痫发作级别均降低,癫痫发作潜伏期均缩短(P<0.05)。这表明恒清Ⅴ号方给药时间越长,癫痫模型小鼠的癫痫发作级别越低,癫痫发作潜伏期越长;恒清Ⅴ号方给药剂量越大,癫痫模型小鼠的癫痫发作级别越低,癫痫发作潜伏期越长。

与模型组比较,各用药组小鼠的血清及海马组织的hs-CRP、HSP-70水平、海马组织GFAP和Fos阳性表达评分均降低,海马CA1区FJB阳性细胞数量减少,大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方低剂量组比较,恒清Ⅴ号方中剂量组、高剂量组及丙戊酸钠组小鼠的血清及海马组织的hs-CRP、HSP-70水平、海马组织GFAP和Fos阳性表达评分均降低,海马CA1区FJB阳性细胞数量减少,大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);与恒清Ⅴ号方中剂量组、丙戊酸钠组比较,恒清Ⅴ号方高剂量组小鼠的血清及海马组织的hs-CRP、HSP-70水平、海马组织GFAP和Fos阳性表达评分均降低,海马CA1区FJB阳性细胞数量减少,大脑皮层和海马中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。结果表明,恒清Ⅴ号方可以降低模型小鼠海马组织GFAP和Fos阳性表达评分及hs-CRP和HSP-70水平,升高GS活性,促进Glu的转化,降低Glu的含量。其作用与剂量有一定关系。

恒清Ⅴ号方可以改善戊四唑诱发的癫痫模型小鼠症状,减轻其海马CA1区神经细胞变性损伤,其作用与剂量呈正相关,作用机制可能是与恒清Ⅴ号方促进癫痫小鼠脑组织Glu的转化、降低血清及海马组织的hs-CRP、HSP-70水平有关。