魏冰 白厚增 靳一哲 杨则宜

北京康比特运动营养研究所（北京100029）

近十年来，预防和控制肥胖成为全球性研究热点。目前较一致的观点是，增加体力活动与限制热量摄入的行为疗法可有效减轻体重，改善肥胖引发的代谢障碍，特别是有氧运动可以促进脂肪酸氧化供能，提高胰岛素敏感性，改善糖脂代谢，调控多种肥胖相关基因表达。但行为疗法不易长期坚持，因此需广泛探寻其他辅助减肥方法。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为茶多酚的主要活性物质，具有强抗氧化活性，能够有效抗肿瘤和降低心血管疾病风险［1，2］，有研究表明EGCG能改善肥胖及相关代谢异常［3，4］。虽然针对EGCG单体的研究增多，但大部分关于减肥的研究仍是针对绿茶提取物或总儿茶素，绿茶提取物或总儿茶素表现出的具体效果并不能完全说明EGCG的作用［5］。左旋肉碱（LC）作为已经投放市场的“明星”减肥产品，其减肥效果有争议［6］。有研究显示，与单独使用相比，联合LC和其他天然提取物，如异黄酮、荷叶提取物等，能较好地改善肥胖机体代谢状态［7］。

肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT1）是脂肪酸β-氧化的关键酶，它对脂肪酸氧化的整个过程都有重要的调控作用。研究亦表明CPT1与机体脂肪沉积有一定关系［8，9］，其表达水平升高有助于增加脂肪酸分解，并降低体脂肪的含量。本研究从整体水平验证运动和EGCG、LC联合对肥胖大鼠的干预效果，为肥胖的治疗和开发新型减肥产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与建立大鼠肥胖模型

4周龄 SPF级 Sprange-Dawley雄性大鼠 174只，体重90～110 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号：SCXK-（军）2007-004。

大鼠适应性饲养1周后，随机选取20只为对照组，饲喂普通饲料；剩余154只为造模组，饲喂高脂饲料，周期8周。饲养环境：温度19～23℃，湿度40～60%，12h/12h昼夜交替。造模期间每周一称量体重，8周后比较两组大鼠重量变化，将高脂饲料喂养组中体重大于对照组平均体重20%的大鼠选出，作为造模成功的大鼠。

饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，辐照灭菌，许可证编号：SCXK京2009-0008。普通饲料中各营养素供能比例为20%蛋白质、70%碳水化合物、10%脂肪；高脂饲料中各营养素供能比例为20%蛋白质、35%碳水化合物、45%脂肪。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

从造模成功的大鼠中随机选取50只肥胖大鼠，将其随机分为5组，每组10只，仍饲喂高脂饲料，进行减肥治疗实验。饲料配方和饲养环境同造模期。具体分组如下：肥胖对照组（F）：饲喂高脂饲料，灌蒸馏水；单纯运动组（S）：饲喂高脂饲料，跑台运动，灌蒸馏水；运动联合EGCG组（E）：饲喂高脂饲料，跑台运动，灌EGCG；运动联合LC组（L）：饲喂高脂饲料，跑台运动，每天灌LC；运动联合EGCG和LC组（EL）：饲喂高脂饲料，跑台运动，灌EGCG+LC。7周后处死，检测指标。本实验在北京联合大学完成。

1.2.2 运动和EGCG、LC干预方法

（1）运动负荷方案：选择中低强度跑台训练，参照Bedford方法［10］，负荷设定为16 m/min，60 min/ day，强度大约相当于58%最大摄氧量。每周运动5天，休息2天，共训练7周。第1周为适应性训练，从6 m/min、10 min开始，以2 m/min、10 min的速度递增至设定负荷。筛除不适应跑台和受伤停训过久的大鼠，每组最终保留6只。从第2周开始为正式实验阶段。

（2）给药方案：EGCG，纯度≥95%，购自浙江乾盛康药业有限公司，生产批号：EG95-00110314H。左旋肉碱酒石酸盐购自广州日康食用化工有限公司，生产批号：D030-1102010。

EGCG和LC补充量均按80 mg/kg体重计算。实验期间每日上午同一时间段内灌胃，灌胃容量为1 ml/100g体重 （体重超过500 g的大鼠灌胃容量均按5 ml配比），F组、S组的大鼠则按照1 ml/100g体重灌胃蒸馏水。

1.2.3 试剂与仪器设备

组织甘油三酯试剂盒购自南京建成公司；CPT1兔多抗购自Santa公司；TFJzol Reagent购自Invitrogen公司；SuperScriptTM III逆转录酶购自Invitrogen公司；5×RT缓冲液购自 Invitrogen公司；2.5 mM dNTP混合液购自HyTest有限公司；2X PCR master mix购自Superarray公司。

Fresco低温冷冻离心机：Thermo公司；Multi-Skan3酶标仪：Thermo公司；Mini P-4电泳槽：Cavoy公司；电泳仪：Bio-Rad公司；水平脱色摇床：其林贝尔公司；酸度计pH211：Hanna公司；电动组织匀浆器：Fluka公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司。

1.2.4 检测指标及方法

实验结束后，于最后1天训练后禁食12 h，以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，称量体重，解剖腹腔，迅速分离肝脏大叶，将取下的组织剪成小块分装入冻存管中，投入液氮冷冻，随后放入-80℃冰箱冻存待测。

内脏脂肪系数测定：分离附着于胃肠道的大网膜、肠系膜及肾周脂肪，清洗三处脂肪后用滤纸吸干，称重，内脏脂肪系数=脂肪重量（g）/体重（g）× 100。

肝脏甘油三酯（TG）水平测定：首先剪取约100 mg组织块，称重。将酶剂用10 ml缓冲液溶解，配置成工作液，静止10 min待用；根据FOLCH方法并加以改进，将甲醇、氯仿、生理盐水按6∶7∶14混合配置为抽提液。按照1 mg组织∶900 μl抽提液加入抽提液，于冰水中匀浆；将匀浆液于4度冰箱中静止12 h以上后，4000 r/min离心10 min，用移液枪小心抽取下层抽提液；在1 ml工作液中加入10 μl下层抽提液，于37度孵育10 min；孵育后3000 r/min离心10 min，取上清液迅速倒入比色杯中，于500 nm处比色，测吸光度值；根据标准曲线计算甘油三酯含量。

实时定量PCR法检测肝脏CPT1 mRNA表达：参照Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司）说明书抽提RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，确认OD260/OD280比值范围在1.8到2.1之间。取RNA 2μg以0.5 μg/μl Oligo（dT）18为随机引物合成CDNA。采用Primer 5.0引物设计软件设计引物，PCR引物长度为278 bp，序列为：CPT1上游 5’GTGGGAGCGACTCTTCAATACT3’，下游5’CAAAATAGGTCTGCCGACACTT3’。Realtime PCR反应体系为10 μl，向前引物和反向引物（10 μM）各0.5 μl，模板2 μl，其余用无RNase水补足。反应条件为：Stage1：（1×）95℃，10 min；Stage2：（40×）Step1：95℃，10 s，Step2：60℃，60 s；Stage3：（1×）95℃，10 s，60℃，60 s，95℃，15 s；缓慢加热到99℃。以管家基因GAPDH作为内参，用样品待测基因值除以此样品内参的值，所得比值为样品待测基因的相对含量。

Western Blot法检测肝脏CPT1蛋白表达：提取NP-40法提取蛋白，在垂直电泳仪（BIO-RAD）上用相同体积的20 μg蛋白质样品经12%SDS-PAGE分离后，转移于NC膜（Millipore）上。用抗体稀释液按1∶5000稀释一抗 （Santa Cruz，Rabbit anti-mouse CPT1）。4℃孵育一抗过夜，洗涤5次，用抗体稀释液按照 1∶10000稀释二抗 （Jackson，HRP conjugated Goat anti-Rabbit IgG；HRP conjugated Rabbit anti-Goat IgG），室温孵育二抗40分钟，1×TBST充分洗涤后，使用ECL试剂盒（Santa Cruz）发光显影，X线胶片压片曝光，扫描定量各条带的相对灰度值。Total-Lab Quant软件读取IOD（积分光密度值），结果用目的蛋白积分光密度值与内参积分光密度值的比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行检验，以平均数±标准差表示。各实验组数据采用单因素方差分析进行多个样本均数间的比较，在满足方差齐性条件下，使用LSD法进行多重比较。显着性水平为P< 0.05。非常显着水平为P<0.01。

2 结果

2.1 体重、内脏脂肪系数、肝脏TG

表1显示：S组、S+E组、S+L组、S+E+L组大鼠体重显着低于F组（P<0.05，P<0.01），S+E+L组显着低于S组（P<0.05）。S+E+L组大鼠内脏脂肪系数显着低于F组大鼠（P<0.01）。S+L组和S+E+L组肝脏TG水平显着低于F组、S组、S+E组 （P<0.05，P <0.01）。

表1 各组大鼠体重、内脏脂肪系数、肝脏TG含量比较

2.2 肝脏CPT1基因、蛋白表达

如表2所示：S组CPT1 mRNA表达与F组比较无显着差异（P>0.05），S+E组、S+L组、S+E+L组CPT1 mRNA表达均显着高于F组和S组 （P<0.05，P< 0.01）。S组CPT1蛋白量与F组比较无显着差异（P> 0.05），S+L组、S+E+L组CPT1蛋白表达较F组显着增加（P<0.05）。

表2 不同组别大鼠肝脏CPT1 mRNA、蛋白表达水平

图1 不同组别肝脏组织CPT1蛋白表达

3 讨论

以往研究表明［11］，运动训练，特别是有氧运动促进体内脂肪含量下降。另有研究证实，有氧运动可以抑制脂肪合成过程，促进异化作用［12］；此外，有氧运动可以促进骨骼肌线粒体对FFA的摄入，提高线粒体β氧化相关酶表达和活性，促进脂肪分解［13］。

EGCG是绿茶茶多酚的主要组成成分。近年来的研究证明了EGCG能改善高脂饮食诱导的肥胖。EGCG能够通过刺激生热作用、促进能量消耗和促进脂肪酸氧化、减少食物的摄取，抑制3T3-L1前脂肪细胞分化等途径起到一定的减肥作用［14，15］。EGCG与运动联合对体重影响的研究较少，且存在争议［16］。

LC是体内长链脂肪酸进入细胞线粒体进行氧化的必需因子，补充LC能促进脂肪的利用，具有减肥作用。LC与运动联合对体重影响的研究比较多，国内外多项实验证明，LC在减肥过程中有良好的辅助作用［17，18］。周斅激［19］将16名肥胖女性随机分为对照组与实验组进行为期12周的减脂实验，两组每星期进行5次有氧健身操练习，每次1小时，实验组每天补充2g LC，对照组服用安慰剂。12周后，实验组与对照组相比，体重、体脂含量、血脂水平、呼吸商（RQ）等均显着下降 （呼吸商越低，燃烧的脂肪越多），说明LC能有效提高有氧运动促进肥胖女性脂肪代谢的作用，增强减肥效果。

本研究中，S组、S+E组和S+L组大鼠体重均较F组显着降低，表明有氧运动及有氧运动联合营养干预是有效的减肥手段。但S+E组、S+L组与S组相比无显着差异，S+E+L组体重较F组及S组均显着下降，各组减体重程度呈S组

本研究结果也显示，S+E+L组大鼠内脏脂肪系数较F组显着下降，说明有氧运动、EGCG、LC三者联合使用对减少内脏脂肪蓄积有明显效果。

本研究中：S+L组和S+E+L组肝脏TG含量明显低于F组、S组、S+E组，提示可以通过添加LC消除肝脏存积过多的脂肪。肝脏是脂类和脂肪的重要代谢器官，当体内缺乏LC时，会引起长链脂肪酸氧化发生障碍，也会导致脂肪在肝中过量存积而发生脂肪肝。增加LC的摄入量，可调节脂肪代谢，促进脂肪的氧化，消除体内或脏器内多余的或存积的脂肪。

CPT1是脂肪酸β-氧化的关键酶，它对脂肪酸氧化的整个过程都有重要的调控作用。有研究表明，在乳清酸引起的非酒精性脂肪肝模型中，大鼠肝脏线粒体CPT的活性明显受到抑制，且CPT1、CPT2 mRNA表达量也显着降低［20］。同时有研究表明，CPT1表达水平与体脂含量相关，表达水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低体脂肪含量［21］。

本研究中，S组CPT1基因及蛋白与F组相比呈增加趋势，但均无显着差异，提示本研究的运动强度在一定程度提高了线粒体β氧化相关酶表达和活性。S+E组、S+L组、S+E+L组大鼠CPT1 mRNA水平显着高于F组和S组，S+L组、S+E+L组大鼠CPT1蛋白表达显着高于F组，说明EGCG、肉碱和两者合用可增强运动减肥的效果。此外，运动联合EGCG对肥胖大鼠CPT1蛋白无明显影响，因此S+L组和S+ E+L组CPT1蛋白水平改变更多依赖LC对CPT1蛋白的作用。

4 总结

运动、EGCG、LC联合使用有减重、减少内脏脂肪和改善肝脏甘油三酯水平的作用，改变肝脏CPT1表达可能是其机制之一。

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