安楠 张漓 徐建方 路瑛丽 赵鹏 赵杰修 何子红 冯连世
国家体育总局体育科学研究所（北京 100061）
运动对成长期大鼠骨骼肌神经肌肉连接形态结构发育的影响
安楠 张漓 徐建方 路瑛丽 赵鹏 赵杰修 何子红 冯连世
国家体育总局体育科学研究所（北京 100061）
目的：探讨神经肌肉连接（Neuromuscular junction，NMJ）形态结构在成长期（断乳－性成熟）的发育特征及运动对这一过程的影响。方法：3周龄（断乳）Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为对照组（C组）、运动组（T组）和悬吊组（H组），运动组和悬吊组分别进行运动增强（跑台运动）和运动减弱（尾部悬吊）干预至8周龄（性成熟），分别于4周龄、5周龄、6周龄、8周龄进行腓肠肌运动终板荧光及组织化学染色和图像测量，比较各组间运动终板形态、数量、面积、周长和胆碱酯酶（AchE）含量的差异。结果：运动终板形态受周龄和运动干预双重影响，对照组4周龄终板面积和终板周长显着高于3周龄（P<0.01），对照组6周龄终板面积和终板周长显着高于5周龄（P<0.01）；对照组4周龄运动终板计数显着低于3周龄（P<0.01）；悬吊组4周龄和5周龄终板计数显着低于同龄对照组（P<0.05）。腓肠肌AchE含量仅受周龄影响，对照组4周龄AchE染色OD值显着高于3周龄（P<0.01）。结论：大鼠成长期NMJ形态在出生后早期（4周龄以前）及青春期均明显发育；其重要的结构成分AchE含量在出生后早期显着升高，之后保持稳定；运动可以在一定程度上促进成长期NMJ形态的发育，具有阶段性显着增长的特征，但不影响AchE含量的稳定。
神经肌肉接头；成长期；发育；形态；结构
神经肌肉连接（Neuromuscular Junction，NMJ）是神经肌肉间进行信号传递、实现运动功能的关键结构。运动终板（motor end plate）即神经肌肉连接位于肌纤维上的部分。出生后NMJ要完成从多神经支配向单神经支配的转化过程，最终结果是每个肌细胞获得一对一的高效率神经支配，这一变化也是突触消除的结果，得以保留的运动终板逐渐呈现出皱褶和分支状态。目前认为，这种变化是不同神经元之间竞争的结果，受多种因素的调控［1］。研究表明，NMJ在哺乳动物出生后的一段时间内表现为快速发育，出生后最初几周，运动终板生长很快，其形态变化与肌纤维直径增加呈正相关，结构也有显着变化［2］，以后逐渐减慢，至成年时形态、结构和功能基本稳定。近十几年来，国内外学者研究发现，神经肌肉活动可以对NMJ的形成、发育和功能进行调控，其中多数研究支持运动干预可以促进NMJ发育［3-5］的结论。如Desaulniers等提出，耐力训练使不同肌肉运动终板N乙酰胆碱受体（nAchR）数目增加，从而使形态发生变化［6］；Deschenes等发现，运动负荷对NMJ发育的促进作用有一定的量效关系［7］，但机制尚不十分清楚；一些由神经和肌肉释放的因子可能参与了这个过程［8］。也有一些研究持相反的意见，如Andonian等［9］对SD大鼠进行30天跑台训练（1 h/day，速度渐增至30 m/min），未发现运动终板周长有显着改变；Lynch等［10］也提出，运动后nAchR和AchE含量均未见变化。虽然对NMJ的研究一直是神经生物学的热点，但目前大量研究只集中在NMJ的发育机制，特别是各种信号及转导过程方面，对于运动调控NMJ发育的确切作用尚不清楚，特别对运动在发育敏感期的作用关注不够。本研究从运动训练学和神经发育科学相结合的角度，观察正常发育及运动干预下大鼠NMJ形态结构的变化，了解NMJ在成长期的发育规律，探讨运动对NMJ发育的作用。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
出生18天的Sprague-Dawley雄性大鼠130只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［动物生产许可证号：SCXK-（军）2007-004］，随机分为对照组（Control Group，C组）50只、运动组（Training Group，T组）40只和悬吊组 （Hanging Group，H组）40只。大鼠饲养和取材均在国家体育总局体育科学研究所SPF级动物实验中心 ［动物使用许可证号：SYXK-（京）2010-030］进行。
C组常规饲养，3周龄时取材10只。T组进行跑台运动，运动负荷从8 m/min、20 min/d开始，运动强度和运动时间交替增加，强度每次增加2 m/min，时间每次增加10min，至8周时达42 m/min、60 min/d。每天上午运动1次，每周运动6天，休息1天。H组采用尾部24小时连续悬吊造成后肢悬空去负荷，身体长轴与地面呈30°角，直至取材。
1.2 实验方法
1.2.1 取材
各组分别于4周龄、5周龄、6周龄、8周龄时取材，每组10只。按0.3ml/100g体重剂量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉，取腓肠肌，置于4%多聚甲醛＋30%蔗糖溶液中于4℃固定48 h后，用DD水清洗，置液氮中快速冰冻后，沿腓肠肌长轴作连续冰冻切片，片厚40μm，切片于室温下风干。每样品选取靠近腓肠肌肌腹中、外三分之一处（此处NMJ含量丰富）切片10张，5张进行荧光组织化学染色；5张进行酶组织化学染色。
以下实验操作均在首都医科大学神经科学研究所进行。
1.2.2 主要仪器和试剂
Leica CM 3050S冰冻切片机 （德国），Leica DM4000 B荧光显微镜 （德国），Leica Qwin图像采集分析系统（德国），Acetylthiocholine iodide（碘化乙酰硫代胆碱）（Sigma，A5751），AgNO3（硝酸银分析纯）（北京中杉），α-Bungarotoxin-tetramethylrhodamine（罗丹明标记的α-BTX）（Sigma，T0195）。
1.2.3 胆碱酯酶（AchE）―镀银染色
选切片入0.1mol/L醋酸缓冲液，浸泡30min。免疫组化笔标记轮廓，滴加AchE染液，4℃过夜；染液配置 （10 mmol/L甘氨酸1 ml＋2 mmol/L硫酸铜1 ml＋50 mmol/L无水醋酸钠1 ml＋0.1 mmol/L醋酸0.1 ml＋0.2 mmol/L异丙嗪1ml＋DD水6ml，染色前向溶液中加入碘化乙酰硫代胆碱11.6mg，终浓度为4mmol/L），所有切片一次染色完成。DD水漂洗5min×5次；切片入10%铁氰化钾显色5～15 min，镜下可见清晰的棕红色即终止。DD水漂洗5min×2次；每样品取5张切片，在Leica DMLA显微镜下每张切片观察5个视野，可见清晰的棕红色运动终板，40×物镜下计数每个视野中完整肌束的运动终板，用Leica Qwin图像采集分析系统采集图像并测量AchE染色OD值。
已进行AchE染色的切片放入DD水浸泡20min，滤纸吸干，滴加20%AgNO3，湿盒内室温避光染色1～2 h；滤纸吸干，切片依次通过10%甲醛5～10s×2次和2%甲醛5～10 s，期间不断摇动切片；蒸馏水速洗，滤纸吸干；滴加氨银液显色20～30 s；氨银液配置（向20% AgNO3中滴加氢氧化铵，边加边摇匀，至溶液转至澄清即停止，用前配置）；切片放入1%甲醛10～30 s，镜下可见清晰的棕褐色神经末梢即终止。上行脱水、透明，树胶封片；在Leica DMLA显微镜下观察并分析AchE－镀银染色切片，每张切片取5个视野，40×物镜下分析神经末梢支配情况。
1.2.4 荧光组织化学染色
选切片置于PBS中振荡漂洗15 min×3次；滤纸吸干，用免疫组化笔标记轮廓，滴加罗丹明标记的α-BTX（1∶100，PBS稀释），置湿盒内室温避光染色1 h；PBS振荡漂洗15min×3次；无荧光甘油封片。在Leica DM4000 B荧光显微镜下观察和采集罗丹明标记的运动终板图像，40×物镜下每张切片取5个视野，在每个视野中选取清晰的运动终板图像，用Leica Qwin图像采集分析系统测量终板面积和终板周长。
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 运动终板AchE染色图像
图1和图2显示了3～8周龄大鼠腓肠肌运动终板AchE染色图像。图1中放大50倍光镜下清晰可见，大鼠腓肠肌NMJ在肌腹上呈典型的倒V形分布。由图2可见，在放大400倍光镜下，运动终板为棕红色椭圆形态，均匀地集中分布在每条肌纤维上。
图1 对照组3周龄大鼠腓肠肌运动终板AchE染色图像（×50）
2.2 运动终板计数及神经支配特征
多因素方差分析显示，周龄和运动干预对运动终板计数均有影响（P<0.01，P<0.05）。5周龄对照组运动终板数量显着低于4周龄对照组 （P<0.01），之后各组间运动终板数量无显着差异；悬吊组4周龄和5周龄时运动终板计数显着低于同龄对照组 （P< 0.05），运动组运动终板数量与C组无差异（见表1）。
在放大400倍光镜下清晰可见运动神经末梢分支支配运动终板的情况（图3和图4）。分析各周龄图像发现，从3周龄开始，NMJ神经支配特征是典型的单神经支配。结果未见运动组及悬吊组与对照组间具有显着差异。
2.3 运动终板形态测量结果
图5显示了各组大鼠腓肠肌运动终板的荧光染色图像。比较各组运动终板形态，可以看到随着周龄增长，终板形态总体增大；相同周龄运动组运动终板大于同龄对照组，皱褶丰富；悬吊组终板小于同龄对照组，皱褶呈萎缩状态。每张荧光染色切片选取5个视野测量运动终板面积和周长，方法如图6所示，结果见表2。
多因素方差分析显示，周龄和运动干预对成长期大鼠腓肠肌终板面积和周长均有显着影响（P<0.01）。对照组4周龄终板面积较3周龄增长了56.14%（P<0.01），对照组6周龄较5周龄增长了38.41%（P<0.01），对照组8周龄较6周龄增长了29.51%（P<0.01）；对照组4周龄终板周长较3周龄增长了47.53%（P<0.01），对照组6周龄较5周龄增长了34.07%（P<0.01），对照组8周龄较6周龄增长了18.92%（P<0.01）。运动组5周龄、6周龄和8周龄终板面积均显着大于同龄对照组（P<0.01），悬吊组4周龄、5周龄、6周龄、8周龄运动终板面积均显着低于同龄对照组（P<0.01），终板周长具有相似的特征（见表2）。
图2 对照组4、5、6、8周龄大鼠腓肠肌运动终板AchE染色图像（400×）
表1 各组成长期大鼠腓肠肌运动终板计数比较（单位：个/400倍视野）
图3 对照组3周龄大鼠腓肠肌运动终板及神经末梢AchΕ-镀银染色图像（400×）
2.4 AchE含量
多因素方差分析可见，周龄是影响腓肠肌AchE的主要因素（P<0.01），运动干预无显着影响。正常发育下，对照组4周龄AchE染色OD值显着高于3周龄（P<0.01），对照组5周龄AchE染色OD值显着低于4周龄（P<0.01）；至8周龄时，运动组及悬吊组与对照组间无显着差异（见表3）。
3 讨论
图4 对照组4、5、6、8周龄大鼠腓肠肌运动终板神经支配情况AchΕ-镀银染色图像（400×）
图5 各组成长期大鼠腓肠肌运动终板荧光染色图像（罗丹明标记的α-BTX荧光染色运动终板，400×）
图6 荧光染色的运动终板图像测量方法示例
表2 各组成长期大鼠腓肠肌运动终板测量结果
表3 各组成长期大鼠腓肠肌AchE染色OD值
本研究发现，4周龄时运动终板计数显着减少，腓肠肌AchE含量增多，这表明多神经支配向单神经支配及多余突触消退过程在大鼠出生后3～4周内基本完成。以往关于出生后NMJ发育的研究多将其定位于出生后很短的一段时间，如Elaine等通过观察胸锁乳突肌将成熟型运动终板出现的时间定为大鼠出生后第2周以前［11］。本研究综合运动终板染色图像及终板计数结果，认为腓肠肌运动终板在出生后的发育高峰是出生后3～4周，这种差异的原因可能是胸锁乳突肌和腓肠肌虽然同属骨骼肌，但其各自功能不同。胸锁乳突肌主要与呼吸时的胸廓运动以及前肢取食动作有关，其发育可能较腓肠肌略早。腓肠肌NMJ发育则与大鼠运动能力的发展过程相适应。SD大鼠出生后10天开始爬行，出生后2周可以行走，伴随着下肢运动能力的增强，是腓肠肌NMJ完成出生后发育的活跃期，得到保留的运动终板逐渐呈现出皱褶和分支状态，最终每个肌细胞获得一对一的高效率神经支配。关于NMJ突触消退的机制一直是研究热点，但观点不一。可能来自突触前、突触后、施旺氏细胞的很多成分连同神经营养因子均参与了这个过程，消退的多余神经轴突可能被施旺氏细胞吞噬清除［12］。
本研究观察到，大鼠5周龄以后出现第2次运动终板形态显着增长的现象。查阅以前研究，无类似文献支持。大鼠出生后到3周龄为幼年期，8周龄以后为成年期，青春期则是大鼠出生后5～8周龄［13］，故推测本研究观察到的第2次快速发育过程与青春期发育有关。大鼠生长发育有两个快速增长时期--幼年期和青春期，NMJ形态出现的第2次发育高峰可能是青春期为适应身体快速增长和运动能力向成年状态转化而出现的。研究表明，大鼠腓肠肌重量增长在整个成长期均呈持续单一的增长趋势［14］，并无与运动终板类似的阶段性显着增长的发育特征，这提示运动能力提高虽以肌纤维持续发展为基础，但神经肌肉控制能力的阶段性变化才可能是运动能力快速提高的重要原因。
运动刺激在NMJ形态发育特别是两个发育高峰期起到重要的作用。本研究发现，运动组成年时运动终板显着大于对照组（P<0.01），而悬吊组则显着小于对照组（P<0.01），表明运动干预改变了运动终板面积和周长，使运动终板面积和周长高于同龄对照水平，抑制运动则使终板面积和周长显着低于正常水平。也有学者认为在这个过程中，突触前膜神经末梢改变比运动终板变化明显，运动训练未引起Ach囊泡数量及nAchR密度改变，而主要引起神经末梢增多［15］。本研究并未在运动组观察到突触前神经末梢分布增多和支配增强的现象，故推测运动不会影响神经末梢与运动终板之间的匹配关系，以保证突触传递的稳定性，NMJ形态的改变可能更多地与运动终板上其它辅助性功能性蛋白成分的变化有关，也可能由于运动使NMJ在肌纤维上的排列更为分散所致。
关于运动终板结构成分是否受运动干预的影响，目前争议较大。有观点认为运动可以改变NMJ突触后膜nAchR的数目，运动训练的影响主要表现在nAchR数量和AchE活性改变［16］。AchE是NMJ重要的结构成分之一。本研究发现在正常发育过程中，AchE于出生后4周显着增多，随后下降，至成年基本保持稳定，这个进程在时间上与NMJ形态第一个发育高峰相对应，以适应NMJ神经传递功能发育的需要。此时nAchR大量表达已经基本完成，多神经支配已经转化为单神经支配，多余NMJ消退，AchE含量增加是功能适应的结果。尽管AchE含量和活性在成长期有所增长，但在一定程度上又是相对稳定的。有研究通过荧光追踪成年大鼠在体NNJ内的AchE，也发现突触间隙的AchE数量和密度相对稳定，而蛋白聚糖复合物α-营养因子缺失的大鼠，其突触间隙AchE丢失率则显着上升，因此，前者可能对保持NMJ中AchE含量及神经肌肉功能稳定性十分关键［17］，成年后AchE对神经肌肉功能的影响主要以活性的改变来实现［18］。本研究中，运动干预对AchE含量无明显影响也说明了这个问题。
4 总结
NMJ形态在出生后早期及青春期各有一次增长高峰，出生后早期的增长高峰结束以终板计数显着减少和AchE含量显着升高为标志；运动可以在一定程度上促进成长期NMJ形态发育，抑制运动则使NMJ形态萎缩，发育延迟，但不影响AchE含量，以保持NMJ自身基本结构和功能的稳定。
［1］Personius KE，Balice Gordon RJ.Activities-dependent synaptic plasticity：Insights from neuromuscular junctions.Neuroscientist，2002，8（5）：414-422.
［2］Grinnell AD.Dynamics of nerve-muscle interaction in developing and mature neuromuscular junctions.Physiol Rev，1995，75（4）：789-834.
［3］Deschenes MR，Judelson DA，Kraemer WJ，et al.Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology.Muscle Nerve，2000，23（10）：1576-1581.
［4］Deschenes MR，Covault J，Kraemer WJ，et al.The neuromuscular junction，Muscle fibre type differences，plasticity and adaptability to increased and decreased activities.Sports Med，1994，17（6）：358-372.
［5］Deschenes MR，Tenny KA，Wilson MH，et al.Increased and decreased activities elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junction.Neuroscience，2006，137（4）：1277-1283.
［6］Desaulniers P，Lavoie PA，Gardiner PF，et al.Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle.Neuroreport，1998，9（16）：3549-3552.
［7］Deschenes MR，Maresh CM，Crivello JF，etal.The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junctionmorphology.JNeurocytol，1993，22（8）：603-615.
［8］Panenic R，Gardiner PF.The case for adaptability of the neuromuscular junction to endurance exercise training.Can JAppl Physiol，1998，23（4）：339-360.
［9］Andonian NH，Fahim MA.Endurance exercise alters the morphology of fast and slow twitch rat neuromuscular junction.Int JSportsMed，1988，9（3）：218-223.
［10］Lynch GS，Rodgers BJ，Williams DA，et al.The effects of age and low-intensity endurance exercise on the contractile properties of single skinned fast-and slow-twich skeletal muscle fibers.Growth Dev Aging，1993，57（3）：147-161.
［11］Elaine M，Humberto SN，Maria JM，et al.Acetylcholine receptor distribution and synapse elimination at the developing neuromuscular junction of mdx mice.Muscle Nerve，2003，28（5）：561-569.
［12］Koirala S，Ko CP.Pruning an axon piece by piece：a new mode of synapse elimination.Neuron，2004，44（4）：578-580.
［13］Laviola G，Macri S，Fletcher SM，et al.Risk-taking behavior in adolescent mice：psychobiological determinant NTs and early epigenetic influence.Neurosci Biobehav Rev，2003，27（1-2）：19-31.
［14］安楠.运动对成长期神经肌肉接头发育的影响.北京体育大学2009届博士毕业论文.2009：47-49.
［15］Fahim MA.Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL/6NNia aging mice.J Appl Physiol，1997，83（1）：59-66.
［16］Alshuaib WB，Fahim MA.Effectof exercise on physiological age-related change atmouse neuromuscular junctions.Neurobiol Aging，1990，11（5）：555-561.
［17］ Martinez-Pena y Valenzuela I，Akaaboune M.Acetylcholinesterasemobility and stability at the neuromuscular junctionoflivingmice.MolBiolCell，2007，18（8）：2904-2911.
［18］王爱萍，史明仪，费文勇，等.补充银杏外种皮多糖对D-半乳糖致衰老小鼠运动能力的影响.中国运动医学杂志，2004，23（6）：695-697.
Effects of Physical Activities on Development of Neuromuscular Junction of Rats in Grow th Period
An Nan，Zhang Li，Xu Jianfang，Lu Yingli，Zhao Peng，Zhao Jiexiu，He Zihong，Feng Lianshi
China Institute of Sports Science，Beijing，China 100061
An Nan，Email：cfaannan@yahoo.com.cn
Purpose The aim of this study was to investigate the characteristics of neuromuscular junction（NMJ）development of rat in growth period（from weaning to sexualmaturity）.Methods3-week-old male Sprague-Dawley ratswere divided into control group（C）training group（T）and hanging group（H）.Hyperkinesia（treadmill-running）and hypomotility（tail-suspension）interventionswere introduced to group T and group H respectively.The morphology，number，area，perimeter and acetylcholinesterase（AchE）content in end plates weremeasured by fluorescent and histochemistry staining at 3，4，5，6 and 8 weeks of age and compared among groups.ResultsThe development of end platemorphology was affected both by age and exercise intervention.The area and perimeter of end plate at 4 weeks of age were significantly greater than that at 3 weeks of age（P<0.01），and greater at 6 weeks of age than that at5 weeks of age（P<0.01）.The end plate number of group H was less than that of group C at 4 and 5 weeks of age（P<0.05）.AchE contentwas affected only by age，and was higher at 4 weeks of age than that at 3 weeks of age（P<0.01），while the end plate number at 4 weeks of age was less than that at 3 weeks of age（P<0.01）.ConclusionNeuromuscular junction grows significantly both inearly period after birth and in adolescence of rats.The structural component-AchE content significantly increases in early period after birth and remains stable thereafter.Though exercises promote the growth of neuromuscular junction to some extent particularly in the sensitive period of development，but do not affect the stableness of AchE content.
neuromuscular junction，growth period，development，morphology
2012.07.31
国家体育总局体育科学研究所基本科研业务费课题（项目编号06-17）
安楠，Email：cfaannan@yahoo.com.cn，Tel：010-87182522
