一次急性力竭运动后大鼠肝T W SG 1、BM P6、SM A D 4 mRNA及肝非血红素铁的时相性变化

王羽 王海涛 王金霞 宋文靖 刘玉倩

河北师范大学体育学院（石家庄050024）

扭转原肠胚形成同系物1（Twisted gastrulation，TWSG1）是近年发现的在维持机体铁稳态中发挥重要作用的铁调控蛋白。TWSG1主要通过抑制肠铁吸收的负调控蛋白肝铁调素（hepcidin）表达而改变机体铁状态［1］。其调控通路主要通过抑制骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）表达［2］，再通过BMP和SMAD4（drosophila mothers against decapentaplegic protein）影响hepcidin合成与分泌。Hepcidin可降低肠铁吸收和巨噬细胞铁释放，调控机体铁状态［3］。本实验室前期研究表明，长时间大强度运动往往引发低铁状态，这与肝hepcidin分泌增加密切相关［4，5］。关于一次急性力竭运动后恢复过程中的铁调控机制及TWSG1的调节作用目前尚不清楚。本实验通过观察大鼠一次急性力竭运动及其恢复不同时期TWSG1、BMP6、SMAD4 mRNA表达和肝非血红素铁的变化，探讨急性运动对铁代谢的调控作用，为促进机体铁稳态恢复，防止运动性铁缺乏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠30只，体重（220±10）g，购自河北医科大学动物养殖中心，动物生产许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。使用国家标准专业啮齿类动物干饲料喂养，自由饮水，自然光照，环境温度20～25℃，相对湿度40%～50%。随即分为对照组（CG组）6只和运动组（EG组）24只。本实验在河北师范大学铁代谢分子生物学研究室进行。

1.2 训练方式

对照组不运动。运动组先在跑台上适应性运动3天，然后进行正常实验。采用跑速30 m/min、坡度为0的一次大强度急性运动直至力竭。力竭标准：大鼠腹部成匍匐状不能前进。

1.3 取材

运动组大鼠分为4组，分别在力竭运动后即刻（E0h组）、3 h（E3h组）、6 h（E6h组）、24 h（E24h组）取材。用1%戊巴比妥纳（1 ml/100g）麻醉大鼠，待大鼠无知觉后，剪开胸腔，使其心脏暴露，用注射器心尖取血，然后用灭活的DEPC水快速灌流，冲净组织内的血液。取肝组织中同一部位的样品50～100 mg装入EP管中，迅速投入液氮，以备做RNA测定。

1.4 RT-PCR 法检测肝组织 TWSG1、BMP6、SMAD4 mRNA表达

cDNA合成：取约100 mg肝组织样品，加入1 ml Trizol（Invitrogen，USA）（100 mg/1ml），在匀浆器中匀浆，磨碎后加入200 μl氯仿，使RNA溶解到氯仿中，震荡后12000 g离心15 min。然后提取上清液加入异丙醇析出RNA沉淀，震荡后12000 g离心10 min，沉淀后的RNA用75%乙醇清洗2遍，晾干加入灭活的DEPC水测定浓度。提取总RNA后开始PCR仪中反转录进行cDNA的合成。采用两步法70℃、10 min，42℃、1h，75℃、15 m i n合成。

PCR 引物碱基序列参考 Tanno［1］和 Babitt等［6，7］的报道，由上海生工合成，内参为β-actin［5］。PCR引物序列β-actin mRNA序列为上游引物5’-ggtcacccacactgtgcccatcta-3’，下游引物 5’-gaccgtcaggcagctcacatagctct-3’，TWSG1 mRNA 序列为上游引物 5’-agggggcgtggacattg-3’，下游引物5’-ctgtgtctccccgtgtcc-3’，BMP6 mRNA 序列为上游引物 5’-gtgtgggcctccgaagaa-3’，下游引物 5’-acactcagctggagtcccatgt-3’，SMAD4 mRNA序列为上游引物5’-caacatccaccaagtaatcgc-3’下游引物5’-ctctcaatagcttctgtcctg-3’。

1.5 肝非血红素铁测定

参照本实验室以往的实验方法［8］。取肝组织用去离子水冲洗后烘干，加入12.5倍体积混合酸，消化20 h。取0.025 ml上清液及铁标准液（Sigma），加入染色剂（bDA，Sigma）1.25 ml，10 min后于540 nm波长测定。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），实验数据以平均数±标准差（±s）表示，显着性水平为P<0.05，非常显着性水平为P<0.01。

2 结果

2.1 肝TWSG 1、BMP 6和SMAD 4 mRNA表达

图1显示，E3h组TWSG1 mRNA表达量显着低于CG组和E24h组（P<0.01），E24h组显着高于其它各组（P<0.01）。E3h组BMP6 mRNA表达显着高于其它各组（P<0.01），E24h组显着低于其它各组（P<0.01）。E3h组SMAD4 mRNA表达显着高于其它各组（P<0.01），E24h组显着高于CG组（P<0.01），但显着低于E6h组（P<0.05）。

2.2 肝非血红素铁含量

E3h组肝非血红素铁显着低于其它各组（P<0.01，P<0.05），E24h组显着高于运动后其它各组（P<0.01，P<0.05），但与CG组相比无明显差异（P>0.05）（表1）。

图1 一次急性力竭运动后大鼠肝铁代谢相关调控基因mRNA表达（n=6）

表1 一次急性力竭运动后大鼠肝非血红素铁含量变化

3 讨论

3.1 一次急性力竭运动后肝TWSG1和BMP6及SMAD4 mRNA的时相性变化

2000年［9］和2001年［10］研究者在《Nature》发表论文，指出果蝇和蛙胚胎中的TWSG1通过抑制BMP途径调控胚胎的生长发育。此后，关于TWSG1的研究主要集中在营养及胚胎的神经、骨等的发育中［11，12］。直到随着对铁代谢中BMP调控通路的逐渐认识［13］，发现TWSG1通过BMP抑制肝铁调素（hepcidin）表达，影响机体铁状态，TWSG1与铁代谢才引起学者关注［1］。进一步研究表明，TWSG1主要通过下调BMP/SMAD信号通路而抑制hepcidin表达，维持机体铁的动态平衡［14-17］。本实验中，大鼠一次急性运动后及不同恢复时间TWSG1表现出明显的时相性变化，运动后3h水平较低，而运动后24h明显增高。TWSG1是对hepcidin转录有抑制作用的基因。而促进hepcidin转录的调控基因BMP6和SMAD4却呈现相反变化趋势，运动后3h水平较高，运动后24h明显下降。这验证了以往研究的结论，TWSG1对BMP6和SMAD4信号通路起抑制作用，TWSG1、BMP6和SMAD4在急性运动中参与调控机体铁状态。铁调素调节蛋白（hemojuvelin，HJV）是位于细胞膜上的一种膜蛋白，在肝细胞、骨骼肌和心肌中均有表达［18］。BMP6在BMP辅助受体-铁调素调节蛋白的参与下与BMP6受体结合，促进位于细胞表面的SMAD1/5/8（转化生长因子β家族成员配体）磷酸化［19，20］。这些激活的SMAD 可依次与SMAD4结合形成复合体，该复合体移动到细胞核调节hepcidin转录［21］。急性运动后不同恢复时间的HJV表达变化还需进一步研究。

3.2 大鼠一次急性力竭运动后肝非血红素铁的动态变化

除了受TWSG1调控，BMP6还可感受机体铁含量变化，通过铁调素调节铁代谢，维持机体铁稳态［22］。肝是机体重要的储铁器官，其中血红素铁是功能性铁，非血红素铁主要是铁蛋白、含铁血黄素等储存铁［23］。本实验结果显示，急性力竭运动后即刻和运动后3 h，肝非血红素铁显着下降，说明机体运动消耗大量铁，为了维持铁稳态，释放储存铁进入循环系统。运动后24 h肝铁储存逐步恢复，这可能与肝细胞膜上的铁摄入蛋白表达量升高有关；也可能与机体铁消耗随运动停止而逐渐下降，肝铁释放减少；还可能是巨噬细胞储存的铁释放及肠铁吸收增加，增加循环系统铁量等有关。其机制仍需研究。

本实验中，肝非血红素铁变化趋势恰与TWSG1的时相性变化一致，推测可能是在运动后初期，机体对运动产生适应性调节，肝贮存铁被动员进入循环系统，增加了血液中的铁含量。为了维持机体铁稳态，TWSG1表达下降，减少对BMP6和SMAD4的抑制，促进hepcidin表达，而降低贮存铁释放和肠铁吸收。随着肝非血红素铁大量损耗，血清铁也逐渐下降［23］，运动后机体为了恢复肝铁贮存量，TWSG1表达上升，抑制BMP6/SMAD4通路，降低hepcidin表达，促进肠铁吸收，维持机体铁稳态。运动后24h，TWSG1表达水平仍较高，而BMP6/SMAD4表达较低，表明一次急性力竭运动对机体铁稳态的影响在运动后24h时仍未完全恢复，如果此时继续大强度运动，可能造成机体铁代谢紊乱，诱发运动性铁缺乏甚至运动性贫血。本实验室前期实验结果说明了这一点［4，5，24］。

此外，在血红蛋白形成前红细胞分化的早期阶段，TWSG1表达较高［1］，说明TWSG1能更早反映铁代谢变化。但能否考虑通过检测血清TWSG1变化，及时调整运动员训练计划，防止出现铁代谢紊乱，尚缺乏深入研究。

4 总结

本次实验发现，一次急性力竭运动中TWSG1、BMP6及SMAD4通路对机体铁状态发挥重要调控作用，一次力竭性运动对机体铁稳态有较大影响，如果长时间进行大强度运动而恢复时间不足，机体可能出现铁代谢紊乱。

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