刘晨敖英芳胡跃林朱敬先焦晨郭秦炜
1北京大学国际医院骨科部（北京102206）2北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）
自体半腱肌腱重建距跟骨间韧带动物模型
刘晨1，2敖英芳2胡跃林2朱敬先2焦晨2郭秦炜2
1北京大学国际医院骨科部（北京102206）2北京大学第三医院运动医学研究所（北京100191）
目的：利用自体半腱肌腱移植建立距跟骨间韧带重建的动物模型。方法：将72只新西兰白兔随机分为重建组、切断组和对照组。分别于4周、8周、16周、32周取材，对3个实验组术前术后体重变化，重建韧带的影像学、组织学和生物力学结果以及术后距下关节的活动范围进行评估。结果：术后8周以后实验动物体重变化出现差别，韧带切断组较重建组体重多增加0.32 kg（P=0.04）；影像学、组织学和生物力学均支持移植韧带成活，生物力学研究发现韧带牵拉时出现2个张力屈服点；术后3组距下关节冠状面（P＜0.05）和水平面（P＜0.001）活动度差异有统计学意义。结论：利用自体半腱肌腱移植重建距跟骨间韧带可有效恢复距下关节的解剖和功能。移植韧带经过坏死、塑形改建、成熟的过程与骨道形成末端结构愈合。对于研究距下关节稳定性、韧带断裂后关节的继发性改变、韧带移植重建的转归提供了良好的动物模型材料。
兔；距下关节；距跟骨间韧带；重建；半腱肌；动物模型
Key wordsrabbit，subtalus joint，introsseos talocalcaneal ligament，reconstruction，autos semitendinosus tendon，animal model
距跟骨间韧带是维持距下关节稳定的主要韧带之一，断裂后主要表现为后足不稳感和疼痛，既往常被诊断为跗骨窦综合征或踝关节不稳［1-3］，近年来部分学者［4，5］将韧带重建技术引入距跟骨间韧带断裂的治疗，取得了初步疗效。我所利用关节镜下韧带重建也取得了满意结果［6］。但对于距跟骨间韧带的重建及病理生理和力学研究仍较有限。本实验通过自体半腱肌腱移植建立距跟骨间韧带重建的动物模型，为距下关节不稳的治疗研究提供实验支持。
1 材料和方法
1.1实验动物
成年健康清洁级新西兰白兔，雌雄不限，6～8周，体重2.0～3.0 kg，购自北京大学医学部实验动物中心。应用epical软件将72只实验动物随机分为6组，每2组合并为1个实验组，并分别选取左侧或右侧后肢进行手术操作。3个实验分组分别为实验组Ⅰ（重建组）：行单侧后肢距跟骨间韧带切断，即刻取同侧半腱肌腱重建距跟骨间韧带；实验组Ⅱ（切断组）：单纯行单侧后肢距跟骨间韧带切断术；对照组：切开距下关节关节囊，冲洗关节腔。72只实验动物中雄性28（39%）只，雌性44（61%）只。其中重建组雄性9（38%）只，雌性15（63%）只；切断组雄性8（33%）只，雌性16（67%）只；对照组雄性11（46%）只，雌性13（54%）只。各组性别构成应用？2检验无统计学差异（P=0.664）。实验报北京大学第三医院实验动物伦理委员会批准。
1.2动物模型的制作
1.2.1麻醉及备皮
20%乌拉坦按每公斤体重5 mg耳缘静脉注射，麻醉满意后自制褪毛剂及备皮刀联合备皮单侧下肢，仰卧位固定四肢，常规碘酒酒精消毒术区，术前氯氨酮0. 5 ml肌肉注射加强麻醉。
1.2.2模型制作方法
1）植入物准备。取膝关节内侧切口纵行切开皮肤、筋膜约1 cm，探查半腱肌腱，取其良好腱性部分约3 m，两端以3-0涤纶编织线编织，距骨端系钢丝自制固定纽扣，跟骨端留出一段长度作为牵引固定线，盐水纱布包裹备用。2）韧带重建。踝关节前方横行切口切开皮肤、筋膜，暴露跗骨窦，11号尖刀直视下切断距跟骨间韧带，注意勿伤及关节软骨面。以2 mm克氏针在距骨体部内侧沿韧带方向自内上向外下钻骨道贯穿至跟骨外侧，将半腱肌腱自距骨侧引入骨道，跟骨侧引出（固定纽扣留于距骨侧）。跟骨贯穿钻孔，将跟骨端编织线一根从钻孔道穿过，与另一根拉紧打结骨桥固定。止血，0.02%稀碘伏冲洗伤口，生理盐水反复冲洗关节腔，丝线缝合皮肤。术后液体石蜡涂抹备皮区，保护皮肤。术日及术后3天前肢肌肉注射20万u青霉素1次/日。术后分笼饲养，自由活动，无特殊康复。
1.2.3取材
实验操作过程中因静脉麻醉药物推注过快致死1只，术后关节内感染1只，剔除后另选2只动物补充。分别于术后4周、8周、16周、32周各取6只实验动物静脉推注空气40 ml处死后即刻取双侧后肢踝足部。
1.3观察指标
1.3.1体重变化
术前及处死后分别称量实验动物体重，体重计精度0.02 kg。对比3组实验动物手术前后体重变化，了解手术对实验动物生活习性和活动状态可能产生的影响。
1.3.2影像学观察
取材后对重建组即刻行影像学检查，包括足正侧位X线片及距下关节MRI。为增强图像信噪比，以兔肌肉组织包裹关节。采用Siemens 3T高场MR（MAGNETOM Trio，Germany）进行MRI检查。采用相控阵小柔线圈（small flex coil，相控4通道）包绕。扫描包括轴面T2W I（TR=4100 ms，TE=80 ms），层厚1 mm，层间距0.1 mm，视野（FOV）80 mm×80 mm，采集矩阵320×320，采集10次成像；斜冠状面T2W I（TR 5000 ms，TE 68 ms），层厚1 mm，层间距0.1 mm，FOV 80 mm×80 mm，采集矩阵256×256，采集7次成像。
1.3.3活动范围的测量
剔除周围肌腱筋膜组织，保留踝距下关节韧带关节囊，保留前足。分别于冠状、矢状和水平面向距骨和跟骨各钻入指示针1枚，距离约1 m垂直于相应面拍摄内外翻（冠状面）、伸屈（矢状面）及内外旋（水平面）位片（踝0°位）。Photoshop CS软件测量3个投射面的活动范围，双侧对比。
1.3.4形态学观察
关节内重建移植物标本，置于10%中性福尔马林缓冲液中固定3天后，于20%甲酸？5%甲醛脱钙液在室温下脱钙1月。脱钙结束后，流动自来水冲洗12小时。经脱水、透明、石蜡包埋，制成5 μm厚切片。后行HE、甲苯胺蓝染色。观察分析关节腔内重建移植物的大体形态和组织学转归。扫描电镜标本投入3%戊二醛固定液（磷酸缓冲液0.1 M，pH 7.2～7.4），室温固定24～48小时。再与固定液相同的磷酸缓冲液中浸洗3次，充分洗去固定液成分。逐级酒精脱水，临界点干燥，导电处理后包埋在金属托上，使用扫描电镜（JEOL公司JSM-5600LV）进行观察。电镜下随机选取胶原暴露清晰的视野，进行拍照。
1.3.5生物力学测定
磷酸处理双侧跟距骨表面，环丙树脂调匀后将跟距骨固定于金属托，操作过程中注意磷酸和环丙树脂勿触及韧带表面。生理盐水纱布包裹标本置于恒温恒湿养护室（温度20℃，湿度90%）3小时，环丙树脂凝固后行生物力学测试。拉力经过韧带轴线，先行预处理，拉伸速度0.05毫米/秒，拉长0.05毫米，反复3次后，行拉脱试验，拉伸速度10毫米/分，试验机记录载荷-位移曲线，视频位移计测量移植物的位移变化量（10帧/秒，以韧带止点中心点作为位移测量点），对曲线修正。软件计算出最大拉脱载荷。统计学分析对结果行配对计量资料的t检验。
1.4统计学分析
采用SPSS 13.0及Excel 2003统计软件分析。计量资料用均数±标准差（¯±s）表示。各组性别构成应用χ2检验；体重变化的统计学分析对结果行一维方差分析和计量资料的独立样本t检验；实验组内术侧同对侧关节活动度比较应用配对计量资料t检验，各组间术侧关节活动度比较应用单因素方差分析和两两比较q检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1体重变化
术后4周，重建组体重变化0.46±0.40 kg；切断组术后体重变化0.72±0.69 kg；对照组术后体重变化0.48±0.39 kg（表1）。利用一维方差分析和多重比较的LSD-t检验可见：重建组和对照组体重变化的差别较小（d=-0.0192 kg，P＝0.896）；而切断组与重建组（d= 0.2563 kg，P＝0.085）和对照组（d=0.2371 kg，P＝0.110）体重变化的差别较大，但统计分析结果显示差异不具有统计学意义。如果不计算术后早期（即4周组）数据（表2），重建组和对照组体重变化差别较小（d=-0.0283 kg，P＝0.855），而切断组与重建组（d=0.3244 kg，P＝0. 040）和对照组（d=0.2961 kg，P＝0.060）体重变化的差别显着性增加。
表1 术后4周各实验组动物体重（kg，各组均n=6）
表2 术后8周各实验组动物体重（kg，各组均n=6）
2.2影像学观察
韧带未见断裂。术后4周时韧带仍较易从骨道拉出。X线可见骨道及内固定位置满意，纽扣周围可见骨痂生长包裹。32周时骨道可见硬化壁及骨道扩大。32周时MRI可见韧带影，形态张力良好（图1）。
图1 术后32周影像
2.3活动范围的测量
各实验组双侧距下关节3个投射面关节活动范围比较采用计量资料配对t检验，结果见表3，切断组在水平面同对侧比较活动范围明显增大。
表3 3个实验组双侧距下关节3个投射面的活动范围（各组均n=6）
3个实验组手术侧3个投射面关节活动范围比较采用一维方差分析和多重比较的LSD-t检验，结果见表4。
2.4形态学观察
术后4周可见重建韧带中央部分以坏死为主，细胞核减少，可见核碎裂；周围有大量成纤维细胞浸润，排列不规律，细胞核主要为圆形和椭圆形；腱骨间为大量成纤维细胞浸润，未见纤维性连接。术后8周重建韧带中央及外周均可见大量成纤维细胞浸润，胶原纤维紊乱，走行大致与韧带长轴一致；腱骨间可见Sharpey样纤维。术后16周重建韧带内成纤维细胞减少，走行趋于一致；腱骨间连接处可见软骨细胞和新生骨间杂排列。术后32周形成类似直接止点的四层结构。图2、图3、图4。
表4 3个实验组术侧距下关节3个投射面的活动范围比对表
图2 术后韧带转归
图3 术后腱骨间愈合
图4 术后32周电镜可见重建韧带胶原纤维平行走行
2.5生物力学测定
32周时重建组韧带与对侧对照组韧带均于距骨止点处断裂。重建组平均最大拉力111.2±4.3 N，为对照组平均最大拉力148.4±4.1 N的75%（表5）。韧带拉伸过程中可见牵引时约在70N左右出现第1次屈服点后拉力曲线继续上升（图5），直至韧带拉断出现第2次屈服点。
表5 跟距骨间韧带重建术后32周韧带拉断试验最大拉力
图5 跟距骨间韧带重建术后32周韧带拉断试验拉力-位移曲线
3 讨论
目前对距跟骨间韧带的重建及病理生理和力学研究仍较有限，其原因之一在于缺少一个理想的动物模型。理想的距跟骨间韧带重建动物模型应具有如下特点：1）适合的动物选择；2）方便获取的移植物；3）成熟的固定方式；4）简便的手术操作。兔作为后足发达善于奔跑的哺乳动物，廉价易于获取。其距跟骨间韧带较为发达，对于维持距下关节的稳定具有重要作用，因此在距跟骨间韧带重建的研究中可提供较为接近人体的解剖结构。半腱肌腱作为常用的肌腱供体，其单股韧带粗细和强度较为接近距跟骨间韧带，一端借鉴交叉韧带固定纽扣的原理自制距骨侧固定纽扣，另一端以骨桥固定于跟骨，固定牢固且避免了距骨过多骨道增加距骨坏死的风险。本实验影像学及病理检查未见距骨坏死表现。
距跟骨间韧带断裂后导致下肢距下关节不稳，进而出现疼痛、不稳等临床症状。Bauer等［7］对26例跗骨窦进行MRI分析，81%跗骨窦的腱鞘囊肿与骨间韧带相关，骨间韧带相关的病例中85%出现关节退变，表明跗骨窦的退变可能和后足生物力学病理变化相关的继发性改变有关。这一变化最终影响患者活动、生活和工作。活动的减少虽可减少距下关节的负荷，但会引起体重等一系列改变，这种情况在临床并不少见。实验动物体重的变化可间接反映各组实验动物术后生活习性和活动状态的改变。重建组和对照组间体重无明显差别，而切断组术后体重增加较其它2组多，提示距跟骨间韧带切断组术后较其它组活动减少，进而体重增加。2个实验组与对照组体重变化差值的比较结果显示，韧带重建术恢复距下关节稳定性后，有助于实验动物恢复正常的生活习性。手术创伤和应激可引起身体代谢和蛋白质、热量的平衡改变，故围手术期其体重变化不能代表距跟骨间韧带断裂和重建对实验动物生活习性乃至体重的影响。将术后4周组动物数据去除，减少了这种影响，能更为准确地观察不同手术对体重的影响。数据结果显示术后8周以上切断组体重增加较另外两组更为明显，且与另外两组差异的统计学意义也逐渐显现。
术后距下关节各向运动同对侧相比均未见明显增大或活动受限。Choisne等［3］的实验显示切断ITCL后距下关节出现内翻不稳和旋转轴不稳。Tochigi等［8］的尸体实验表明距跟骨间韧带切断后无论轴向牵拉或侧向应力均增加中央区的松动和屈曲活动。由于对距下关节的运动机制尚无统一认识，因此各作者对距跟骨间韧带在距下关节稳定性的作用观点不一，但是多数作者都认为距跟骨间韧带是距下关节稳定的主要韧带之一［9］。人距跟骨间韧带由外下斜向内上走行［10，11］，而兔距跟骨间韧带较人与地面平行，其主要作用是维持跟距骨间水平面的活动，断裂后水平面内外旋活动范围增大，通过重建手术可有效恢复距跟骨间韧带的稳定作用。
配对资料显示距跟骨间韧带切断术后距下关节水平面内外旋活动范围（21.37±5.97）较对侧（14.88±9. 56）明显增大（P=0.032），而重建组水平面活动范围与对侧无显着性差异（P=0.346）。可见距跟骨间韧带的主要作用是维持跟距骨间水平面的活动，断裂后水平面内外旋活动范围增大，通过重建手术可有效恢复距跟骨间韧带的稳定作用。比较3组手术侧的活动范围也可看出切断组较重建组和对照组水平面活动范围均明显增加（P＜0.001），可见韧带重建手术可恢复距下关节内外旋稳定性。在冠状面虽然3组数据术侧同对侧活动范围比较均无显着性差异，但重建组和切断组均较对照组活动范围增加，以切断组尤为明显，说明距跟骨间韧带在维持距下关节冠状面内外旋稳定中亦起到重要作用。重建组重建手术未能完全复制距跟骨间韧带的解剖和功能，分析原因是重建韧带尚难以完全代偿原有韧带的解剖与生物力学功能。无论是配对资料还是3组手术侧资料的比较，3组实验动物距下关节矢状面活动范围均无明显差异，表明韧带对兔距下关节矢状面伸屈活动无明显影响。研究兔距跟骨间韧带发现，韧带走行与矢状位运动轴一致，故对关节伸屈运动影响较小，但这能否表示人距跟骨间韧带对于距下关节矢状面伸屈活动的意义值得商榷。
距跟骨间韧带可在核磁质子相清晰显示［12，13］。本实验核磁共振成像可观察到重建的骨间韧带，实验32周组可观察到骨道扩大，而4至16周组均未见到明显骨道扩大。多数作者认为骨隧道扩大在术后6个月内发生，1年内达到稳定［14］。可见韧带重建后骨道的形成是一个复杂的过程。骨道扩大的原因可归纳为多种理化和机械性因素，最主要的原因是应力作用。并特别提出移植物在骨隧道中的运动包含“雨刷效应（wind-shield wiper effect）”和“拉橡皮筋效应（bungee effect）”。骨道扩大的出现说明重建韧带长期受到应力作用，间接反映了重建韧带的功能。
术后2周韧带仍可轻易从骨道内拉出，术后4周切片时重建韧带从骨道中脱出，表明韧带与骨道结合尚不牢固，仍易与骨道分离。韧带重建术后，重建韧带需要经过坏死、塑形改建、成熟等过程，最终韧带与骨道形成末端结构完成愈合的全过程。这一过程大致需要6个月至1年［15］。本实验重建韧带经历了相似的病理过程，在32周时韧带与骨道形成成熟的末端结构，但这种末端结构并不均一，图中所见末端结构软骨细胞增生较多，这种现象可能与止点不同部位所受牵引力大小和方向有关，从而介导了软骨化生的过程。
生物力学实验显示重建组韧带与对侧正常韧带断裂均位于距骨止点处，目前原因尚不十分清楚，可能与距骨尤其是韧带止点寡血供有关。32周时重建韧带断裂强度为对照组韧带的75%，考虑应为肌腱和韧带组织的特征性表现。初始的上升阶段可解释为弹性阶段，在这一阶段变形完全是弹性的，此时将载荷卸掉，则变形完全消失，样品恢复原状，这一阶段应力与应变成正比，最高点对应的应力值，称作材料的比例极限。超过比例极限后的弯曲上升段，此时应力与应变不成正比，但仍是弹性变形；此后的下降段称为屈服阶段，这时的变形为塑性变形，可能是韧带材料内的胶原纤维发生了局部的撕裂造成的，因此出现应力的下降；此后，又出现成直线的上升段，称为强化阶段，可解释为加工硬化造成的，可能的原因是胶原纤维发生缠结，因此暂时提高了韧带材料的强度，需要更大的力来破坏胶原纤维的缠结；当胶原纤维的缠结被破坏时，到达直线的顶点，韧带被完全撕裂，因此应力垂直下降到很低的值，此时韧带完全断裂。强化阶段曲线斜率较弹性阶段小，可能与强化阶段韧带已遭到实质性破坏有关。弹性阶段需要破坏胶原-纤维，故应力-应变曲线斜率较高，而强化阶段是改变断裂的胶原纤维卷曲残端的构型，故应力-应变曲线斜率较低。
利用自体半腱肌腱移植重建距跟骨间韧带的动物模型可基本有效重建距下关节的解剖结构和功能，恢复因韧带断裂引起的距下关节不稳，对于研究距下关节稳定性，韧带断裂后关节的继发性改变，韧带移植重建的转归提供了良好的动物模型材料。
［1］Mittlmeier T，Wichelhaus A.Subtalar joint instability.Eur J Trauma Emerg Surg，2015，41（6）：623-629.
［2］Lee KB，Bai LB，Song EK，et al.Subtalar arthroscopy for sinusTarsisyndrome：arthroscopicfindingsandclinical outcomes of 33 consecutive cases.Arthroscopy，2008，24（10）：1130-1134.
［3］ChoisneJ，RinglebSI，SamaanMA，etal.Influenceof kinematic analysis methods on detecting ankle and subtalar joint instability.J Biomech，2012，45（1）：46-52.
［4］Kato T.The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint.J Bone Joint Surg Br，1995，77：400-406.
［5］NorioU，SuguruI，EiichiH.Methodandresultsfor reconstruction of talocalcaneal interosseous ligament using subtalar arthroscope.18th annual meeting of the Arthroscopy Association of North America，1999.
［6］Liu C，Jiao C，Hu YL.Interosseous Talocalcaneal Ligament Reconstruction With Hamstring Autograft Under Subtalar Arthroscopy.Foot&Ankle International，2011，32（11）：1089-1094.
［7］Bauer JS，Müller D，Sauerschnig M，et al.Ganglia of the tarsal sinus：MR imaging features and clinical findings.Eur J Radiol，2011，80（3）：e394-e400.
［8］Tochigi Y，Amendola A，Rudert MJ，et al.The role of the interosseous talocalcaneal ligament in subtalar joint stability. Foot Ankle Int，2004，25（8）：588-596.
［9］Kamiya T1，Kura H，Suzuki D，et al.Mechanical stability of the subtalar joint after lateral ligament sectioning and ankle brace application：a biomechanical experimental study.Am J Sports Med，2009，37（12）：2451-2458.
［10］Li SY，Hou ZD，Zhang P，Ligament structures in the tarsal sinus and canal.Foot Ankle Int，2013，34（12）：1729-1736.
［11］JotokuT，KinoshitaM，OkudaR，etal.Anatomyof ligamentous structures in the tarsal sinus and canal.Foot Ankle Int，2006，27（7）：533-538.
［12］Thacker P，Mardis N.Ligaments of the tarsal sinus：improved detection，characterisation and significance in the paediatric ankle with 3-D proton density MR imaging.Pediatr Radiol，2013，43（2）：196-201.
［13］Lee KB，Bai LB，Park JG，et al.Efficacy of MRI versus arthroscopy for evaluation of sinus tarsi syndrome.Foot Ankle Int，2008，29（11）：1111-1116.
［14］JanssonK，HarilainenA，SandelinJ，etal.Bonetunnel enlargement after anterior cruciate ligament reconstruction withthehamstringautograftandendobuttonfixation technique.A clinical，radiographic and magnetic resonance imaging study with 2 years follow-up.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，1999，7：290-295.
［15］Shino K，Kawasaki T and Hirose H，et al.Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogenic tendon graft.An experimental study in the dog.J Bone Joint Surg Br，1984，66：672-681.
Animal Model of Reconstructed Interosseous Talocalcaneal Ligament
Liu Chen1，2，Ao Yingfang2，Hu Yuelin2，Zhu Jingxian2，Zeng Xiangzhu2，Jiao Chen2，Guo Qinwei2
1 Department of Orthopaedics，Peking University International Hospital，Beijing，China 102206 2 Institute of Sports Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing，China 100083
Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com
Objective To establish an animal model of reconstructed interosseous talocalcaneal ligament（ITCL）using autos semitendinosus tendon.Methods 72 matured New Zealand white rabbits were randomly divided into control group，ITCL reconstruction group，and ITCL amputation group.Every 6 rabbits from each group were respectively sampled at week 4，8，16，and 32 after the operation，and their changes in body weight，image，histology and biomechanics of reconstructed ITCL，and the range of motion（ROM）of subtalar joint were compared among the three groups.Result The body weight in ITCL amputation group increased by 0.32 kg as compared with the ITCL reconstruction group（P=0.04）after 8 weeks of the operation.The reconstructed ITCL survived well enough in the respects of their image，histology and biomechanics.Two tensile yield points appeared when the ligament was stretched.The ROM of subtalar joint was significantly different among the three groups at coronal plane（P＜0.05）and horizontal plane（P＜0.001）.Conclusion Anatomy and function of subtalus joint after rupture of ITCL can be reconstructed effectively using autos semitendinosus tendon.
2015.12.06
敖英芳，Email：yingfang.ao@vip.sina.com
