史晓伟周学兰
1海南师范大学体育学院（海南省 海口市 571158）2上海体育学院运动科学学院
TGF-β1多效性与肌腱修复研究进展
史晓伟1，2周学兰1
1海南师范大学体育学院（海南省 海口市 571158）2上海体育学院运动科学学院
肌腱修复历来困扰着腱病患者，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作为参与肌腱修复的重要因子，它在修复过程中的多种生物学效应备受关注。本文就肌腱修复过程中TGF-β1的表达，TGF-β1在肌腱修复中的多效性及其参与肌腱修复途径的研究现状进行综述，以期为最终了解肌腱修复机制提供参考和依据。
TGF-β1；多效性；肌腱；修复
TGF-β1广泛存在于人和哺乳动物体内，是三种亚型结构（TGF-β1、2、3）中最为活跃的因子。作为转化生长因子家族成员里重要的一员，TGF-β1已被广泛应用到组织损伤的修复当中。长期以来，科研工作者对TGF-β1在肌腱修复中的作用持不同看法：它既能促进腱细胞增殖，调节细胞外基质；又能产生瘢痕和粘连，引起肌腱纤维化。2012年，美国罗切斯特大学学者Farhat在PLoS One杂志上刊登的一篇关于屈肌腱修复实验的论文，其标题中首次使用了“the pleiotropic effects of TGF-β1（中文暂译：TGF-β1多效性）”，虽然他对屈肌腱修复中TGF-β1所起的正反两方面作用进行了初步的探讨[1]（促进胶原表达上调使肌腱再生；破坏细胞外基质平衡性导致肌腱纤维化），遗憾的是并未对TGF-β1多效性做出明确的解释。尽管如此，TGF-β1多效性的提出还是让人为之兴奋。TGF-β1多效性可初步理解为：TGF-β1在肌腱修复中表现出促进和/或阻碍肌腱修复的多重生物学效应。这与有机整合TGF-β1在肌腱修复中不同作用的想法不谋而合：既能言简意赅表达TGF-β1的多重生物学效应，又为今后进一步研究留有空间。对于肌腱修复过程中TGF-β1多效性，目前还没有确凿的证据表明TGF-β1究竟是一个“好”因子，还是一个“坏”因子，这也成为了肌腱修复研究中的热点和难点。本文综述肌腱修复过程中TGF-β1的表达、TGF-β1在肌腱修复中的多效性及其参与肌腱修复的途径，以期为了解肌腱修复提供参考。
1 肌腱修复过程中TGF-β1的表达
目前研究发现TGF-β1在肌腱修复过程中表达升高，但升高开始的时间点并不一致。Dahlgren[2]给14匹马前肢的趾浅屈肌腱注射胶原酶以诱导肌腱损伤，并进行了为期24周的观察，发现自然修复开始的第1周TGF-β1即达到高峰。夏长所[3]采用标准Kessler缝合法修复成年新西兰兔被切断的左前中趾屈趾深肌腱，在修复第1天TGF-β1表达增加，14～21天达高峰，至第56天仍保持在一定水平。Würgler-Hauri[4]将20只SD大鼠双侧冈上肌腱进行手术分离，并在第1、2、4、8、16周观察冈上肌腱自然修复情况，TGF-β1在第1～2周开始升高，一直保持到第8周，之后便无法测出。Heisterbach[5]切断大鼠跟腱并进行手术缝合，发现TGF-β1表达在修复第8周显着增加。笔者[6]采用电刺激跳跃法对Wistar大鼠进行5周跳跃练习，成功制造跟腱末端病模型，研究发现与造模对照组比较，低功率激光修复可使大鼠跟腱TGF-β1在第1天升高，并在14天内表达出较高水平。TGF-β1在时间点上表达的不同可能与实验动物种类、肌腱损伤类型、修复方式不一致有关。
也有个别研究表明肌腱修复过程中TGF-β1表达并不总是升高。Favata分别取成年羊和幼羊侧伸肌肌腱，切成2 cm长，缝合至专用手术微型钢架并移植入成年SCID雌鼠皮下袋中，在第1、3周之后打开植入部位并露出移植的肌腱，研究发现成年羊肌腱修复中TGF-β1表达上调，而幼羊肌腱却无此变化[7]。这可能与二者肌腱修复方式不同有关，TGF-β1在成年羊和幼羊肌腱修复中表达不同也许只是修复方式不同的原因之一，同时提示幼羊肌腱有区别于成年羊肌腱的修复方式。因此Favata[7]在实验中推断幼羊肌腱修复依靠的
是正常排列胶原纤维的快速再生、最小炎性细胞浸润和炎性细胞因子表达的无疤痕修复。这说明了解幼年肌腱修复方式也许会对成年肌腱修复提供帮助。
在肌腱修复过程中，对TGF-β1表达的研究是探讨其在肌腱修复中作用的基础，虽然目前研究结果不太一致，但是大部分显示TGF-β1在肌腱修复过程中表达升高，这至少表明了TGF-β1在肌腱修复中起重要作用。
2 TGF-β1在肌腱修复中的多效性
2.1 TGF-β1在肌腱修复中多效性的表现
TGF-β1在肌腱修复中起重要作用，并不是单向有利或有害，而是具有多效性，因而对于TGF-β1在肌腱修复中作用的分歧较大，争议不断。
Bell将6 μl生理盐水（含100 ng hrTGF-β1和0. 1%超纯牛血清白蛋白），注射入小鼠跟腱中部，1天后让小鼠在倾斜角度17°、速度0.32 m/s的跑台上持续跑2周，每天20分钟，每周5天，成功制造出小鼠跟腱末端病模型，该跟腱最大拉伸应力减少约66%，这与跟腱内大量软骨细胞的产生有密切关系，因此，他认为通过注射TGF-β1可引起小鼠肌腱末端病[8-9]。袁国庆[10]也提到通过注射白细胞介素（interleukin，IL）、TGF-β、生长因子（growth factor，GF）等诱发炎症反应从而造成肌腱末端病。Stone用自备的细胞因子注射至新西兰兔的髌腱中部引起肌腱的损伤[11]，但遗憾的是并未说明确切的细胞因子组合。这些研究或是通过TGF-β1注射加上运动制造末端病模型，亦或是与其他细胞因子共同注射以致肌腱损伤，缺乏TGF-β1独立制造末端病的证据，因此并不能明确证实TGF-β1是腱病的致病因素。但是从现有的报道中依然可以发现TGF-β1可能与腱病的产生相关，但其中的关系目前还不清楚。
许多文献报道支持TGF-β1参与肌腱粘连和瘢痕形成。目前研究多是通过抑制TGF-β1表达揭示其对肌腱修复的不利影响，如壳聚糖、6-磷酸甘露糖、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、TGF-β1中和抗体、miRNA、反义TGF-β1转基因等，这些方法不同程度改善了肌腱修复环境，提高了肌腱所在关节的活动度，对肌腱粘连和瘢痕形成起到预防和治疗作用[12-19]。减少粘连和瘢痕固然对肌腱修复有利，但是只通过抑制TGF-β1表达来减少粘连和瘢痕并不一定能够提高肌腱的力学性能，从肌腱功能恢复的角度来看，愈合肌腱的力学性能可以反映出肌腱修复的质量，这也是肌腱修复目的之一。Kim[20]利用渗透泵将TGF-β1、2、3中和抗体注射至大鼠肩峰下间隙并没有改善冈上肌腱—骨的愈合，反而降低了冈上肌腱的力学性能。Zhou[21]通过含miRNA的RNAi质粒沉默TGF-β1表达来预防屈肌腱粘连，但是肌腱修复后的最大抗拉伸力量较差。Kim与Zhou的实验不仅说明了减少肌腱修复中粘连和瘢痕的重要性，而且指出了肌腱修复中力学性能也应同样得到重视。
尽管以上研究认为TGF-β1不仅与腱病的产生相关，而且还参与肌腱纤维化过程，但是与之截然相反的观点也大量存在。TGF-β1可促进肌腱愈合[22]、减少肌腱纤维组织机械磨损缺陷[23]、加快肌腱重塑[24]和恢复肌腱力量[25-26]等。目前许多研究已经把TGF-β1作为损伤肌腱修复有效的重要标志之一：Inoue[27]用刺激频率50 Hz、强度20 μA和持续20 min的电针疗法修复大鼠跟腱，发现7天后TGF-β1大量表达，10天后跟腱最大断裂力量显着提高，表明电针疗法有利于跟腱修复。除了应用电针疗法修复肌腱外，低功率激光对肌腱修复也起到了积极作用。低功率激光通过上调TGF-β1表达或延缓其表达下降，刺激ATP合成并增加细胞内钙离子浓度，促进腱细胞的增殖和胶原的合成，改变炎症反应，加快肌腱修复速度[6，28-29]。肌腱作为致密结缔组织，损伤之后完全恢复时间较长，对于下肢爆发力涉及较多的运动员，其跟腱损伤可能需要成年累月的康复治疗才能恢复。而上述研究相对于漫长的恢复时间只能算是肌腱修复的早期阶段，因此，对于TGF-β1促进肌腱修复的作用究竟最长能够维持多久，目前尚无定论，这也为接下来的研究提出了新的方向和挑战。
另外有个别报道显示TGF-β1对肌腱修复没有影响。Fenwick[30]对TGF-β三种亚型及两种受体在慢性损伤跟腱中作用进行研究，发现基质中并没有TGF-β1和TGF-β3表达，因而认为外源性添加TGF-β1在慢性腱病中几乎无作用。
综上，TGF-β1在肌腱修复中多效性表现为：既能参与肌腱粘连和瘢痕的形成又能促进肌腱的愈合。从目前掌握资料来看，TGF-β1既参与肌腱粘连和瘢痕形成，又促进肌腱愈合的不同作用说明它并不是一个单向调节肌腱修复的因子，究竟真正参与肌腱修复的作用到底是什么还需进一步的研究。
2.2 TGF-β1在肌腱修复中多效性的原因
目前对TGF-β1在肌腱修复中的作用还有较大分歧。国内持“TGF-β1参与肌腱粘连和瘢痕形成”观点的学者多从肌腱的外源性愈合来解释；而认同“TGF-β1促进肌腱愈合”的学者又会从肌腱的内源性愈合角度来分析。也有人认为肌腱粘连形成的主要原因是肌腱外源性愈合和内源性愈合的不平衡结果所致[31]，并对肌腱的外源性愈合和内源性愈合进行了初步的分析。但从现有资料来看，肌腱外源性愈合和内源性愈合的观点尚在探索之中，还未被广泛认可，其原因有三点：一是国内虽有文献将肌腱愈合分为外源性愈合和内源
性愈合，但认为二者是人们在肌腱愈合认识中产生的截然相反观点[32]，还没能完善和形成有机的、统一的理论去解释肌腱修复；二是国外鲜有将肌腱愈合简单分为外源性愈合和内源性愈合的报道；三是肌腱修复是一个极其复杂的过程，目前对其机制了解尚不清楚。
既然TGF-β1在肌腱修复中多效性表现为：既能参与肌腱粘连和瘢痕的形成又能促进肌腱的愈合，那么究其主要原因可能涉及以下几点。首先，TGF-β1对肌腱细胞外基质平衡性的影响。细胞外基质平衡是维持肌腱正常功能的基础，胶原作为细胞外基质中重要的组成，笔者曾研究发现末端病大鼠跟腱中胶原结构混乱和代谢失衡贯穿于跟腱末端病的整个发病过程，且胶原的合成和降解处于动态之中[33]，而TGF-β1可以通过刺激胶原的合成参与肌腱修复，问题也就此产生：胶原的合成到底有没有上限，会不会在肌腱中因过分合成而满足肌腱愈合的同时又打破胶原的平衡而引起粘连和瘢痕？答案尚在探索之中。对于细胞外基质中的另外一个重要成分——蛋白多糖（decorin）目前也逐渐被人们关注，其对胶原修复的作用主要是抑制胶原纤维化形成[34]，TGF-β1同样也能抑制蛋白多糖的表达[1，35]，由此可知TGF-β1能通过抑制蛋白多糖参与肌腱修复，但这并不能简单理解为蛋白多糖被TGF-β1抑制后，肌腱一定会出现纤维化，因为TGF-β1对细胞外基质是整体、复杂的调控，它影响细胞外基质平衡，但影响如何还不清楚。其次，TGF-β1对肌腱力学性能的影响。文献中既有TGF-β1增加肌腱力学性能的报道[36-37]，又有用抑制或沉默TGF-β1表达的方法减少肌腱纤维化从而导致肌腱力学性能下降的结果[20-21]，基于TGF-β1参与肌腱纤维化的前提，却未能同时提高肌腱的力学性能，由此说明TGF-β1参与肌腱修复过于复杂化。最后，TGF-β1在肌腱中表达持续时间长短、表达量多寡、表达部位多有不同（肌腱、骨腱结合部、腱鞘）。由于实验研究中材料种类、肌腱损伤类型、修复方式选取不同，TGF-β1在肌腱中表达情况并不一致，其在肌腱中的作用也不同，因此张林等人[38-39]猜测TGF-β1作用可能具有“双面性”，但未能做进一步的分析。上述的可能原因并不孤立存在，而是复杂关联，因此对TGF-β1多效性的原因探讨仅仅是初步性的，还需更多实验去证实、分析和总结。在对TGF-β1多效性的研究基础上，通过不同方法及手段对TGF-β1在肌腱修复中多效性进行调控和整合将会是未来肌腱修复研究的热点。如何使TGF-β1“扬长避短”——只表现出对修复有利的一面而摈弃其不利？这种“理想修复”究竟存不存在？带着这些疑问，科研工作者需要对TGF-β1在肌腱修复中的作用继续进行深入探究。
3 TGF-β1参与肌腱修复的途径
尽管已有许多证据表明肌腱粘连和瘢痕的形成是由于TGF-β1，也有实验证明TGF-β1促进肌腱愈合，这里先暂不讨论其对肌腱修复所起作用是否有利，仅就TGF-β1参与肌腱修复的途径，目前还不完全清楚。为了了解肌腱修复的机制，首先要清楚TGF-β1参与肌腱修复的途径，现从已有文献中归纳并总结出以下3种途径。
3.1 直接作用
TGF-β1可能通过破坏细胞外基质平衡性直接影响肌腱的修复。Farhat[1]用不同浓度TGF-β1（1、10、100ng/ml）处理培养中的屈肌腱细胞，基质金属蛋白酶-16（matrix metalloproteinase-16，MMP-16）、蛋白多糖表现出剂量依赖性的表达下调、双糖链蛋白聚糖（biglycan）、胶原V、胶原XII、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）等表现出剂量依赖性的表达升高，TGF-β1直接改变了细胞外基质的平衡，导致肌腱粘连和瘢痕形成。也有研究认为TGF-β1通过直接抑制蛋白多糖表达使肌腱基质紊乱[35]。其他的一些研究包括：TGF-β1直接产生了抑制MMP-2和纤溶酶（plasmin）生成的PAI-1[40]；TGF-β1加强了与瘢痕组织形成密切相关成纤维细胞的收缩程度，进而形成瘢痕[41]；TGF-β1直接激活了起粘连作用COMP/ TSP-5基因表达，从而产生肌腱粘连[42]。
除了上述TGF-β1的直接作用使肌腱形成粘连外，有人研究发现皮肤、韧带、半月板、软骨和肌腱修复过程中均有α肌动蛋白的参与，TGF-β1处理人肩袖腱细胞可显着增加α肌动蛋白的含量，因此TGF-β1直接产生α肌动蛋白有利于肌腱修复[43]。另外有报道TGF-β1能直接改善肌腱力学性能，如髌腱中心部分被切除后，TGF-β1显着增加了其纤维组织切线模量（tangent modulus）和抗拉力量[36]；TGF-β1显着提高了应力屏蔽髌腱的力学性能，对应力屏蔽髌腱的重塑起重要作用[37]。
3.2 协同作用
许多文献提及富血小板血浆已被应用于肌腱修复当中[44-46]，它可以长期分泌并大量释放出多种生长因子，包括TGF-β1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等[47-52]，上述生长因子通过促进成纤维细胞有丝分裂周期的完成，协同参与肌腱的修复和愈合[53]。TGF-β1与其他生长因子协同作用对肌腱修复的研究现已逐渐增多，使用富含TGF-β1和多种生长因子的富血小板血浆不仅可以长时间促进
肌腱修复，而且还能从TGF-β1与其他生长因子之间的相互关系入手对其进行研究，这为今后了解这种协同作用的机制有很大帮助。
除富血小板血浆外，体外冲击波也可通过介导TGF-β1、IGF-1与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的高表达促进腱细胞增殖、胶原合成及组织再生[54-55]。
在修复早期，经羊膜上皮细胞（amniotic epithelial cells，AEC）处理过的肌腱有更好的结构和力学性能，并证实肌腱修复由TGF-β1和VEGF共同完成[56]。
另有报道证实TGF-β1与生长分化因子-5（growth differentiation factor-5，GDF-5）能共同促进肌腱力量恢复[57]。IGF-1和TGF-β1联合处理可使间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）产生腱细胞[58]。TGF-β1与TGF-β1/VEGF165在肌腱修复过程中表达增高，TGF-β1消除VEGF165的不利作用，而VEGF165却不影响TGF-β1促进胶原合成的作用，协同参与肌腱的修复[59]。
目前对TGF-β1参与肌腱修复协同作用途径的研究主要集中于TGF-β1与其他细胞因子共同作用于肌腱修复，而对其他可能的协同因素如物理刺激（运动、机械载荷）等目前还鲜有报道。在与细胞因子的协同作用中，TGF-β1究竟如何发挥作用，发挥了多大作用，这种作用能够持续多久，目前还不清楚。
3.3 信号通路
也有文献通过对TGF-β1信号通路抑制，减少肌腱粘连和瘢痕促进肌腱修复的研究。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）通过对TGF-β1信号通路的调控减少肌腱粘连，并保持修复过程中的屈肌腱力量[60]。HGF处理可促进肌腱成纤维细胞AMPK磷酸化和提高乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）活性，通过AMPK信号通路阻滞剂抑制AMPK信号通路，可弱化HGF对TGF-β1引起的肌腱成纤维细胞分化抑制作用，而siRNA介导AMPKα1基因敲除减弱HGF对TGF-β1抑制作用，反之持续过度表达的AMPKα1可在肌腱成纤维细胞中激活AMPK信号通路，模拟了HGF的抑制作用，因此，HGF抑制TGF-β1产生的肌腱纤维化是通过肌腱成纤维细胞中AMPK信号通路的作用实现的[61]。由于TGF-β1信号通路较为复杂，在肌腱修复中对TGF-β1信号通路的研究目前较少，相信将来会有更多这方面的研究出现。
4 小结
TGF-β1在肌腱修复中的多效性说明它不是单向调节因子，在肌腱修复中的作用目前争议还较大，需要更多的后续研究去甄别证实，以期调控其多效性促进肌腱修复。目前对于TGF-β1参与肌腱修复途径的研究还不成熟，后续的研究可能会丰富肌腱修复途径，为最终了解肌腱修复机制提供参考和依据。
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2015.04.30
海南省自然科学基金资助项目（20158361）
周学兰，Email：631603000@qq.com
