李岳 傅世铨 黎广平 冯华

1北京积水潭医院运动医学科（北京 100035）

2香港中文大学 3北京市创伤骨科研究所

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤是运动医学领域的常见病。ACL损伤可以分为完全撕裂和部分撕裂。据不同文献报道，部分撕裂占全部ACL损伤的5%～15%。这部分患者如果不进行处理，那么在5年后，高达78%的患者会进展为完全撕裂，进而出现膝关节前向不稳定，86%的患者会出现半月板损伤[1-3]。

对于ACL部分撕裂的治疗，学术界争议较大，对于关节不稳定的患者，治疗方式绝大部分为手术；对于关节稳定的患者，则进行保守观察，没有进一步的治疗措施。手术治疗创伤较大，术后康复时间长，对患者生活质量影响大，保守治疗病情有很大可能性出现恶化，进而转变为完全撕裂。因此，对于ACL部分撕裂患者，目前仍然缺乏让医患满意的，同时满足小创伤、短康复、对生活质量影响小，同时有效防止病情进展的治疗方式。

但是，由于关节腔空间大，ACL两断端缺乏有效连接，即便形成局部血肿也难以填充损伤区域，另外，关节液中的尿激酶等物质会抑制炎症因子、生长因子及纤维蛋白原的产生，因此，上述两大物理、化学因素使得ACL在自然条件下的愈合能力非常差[4]。近期的研究发现，富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）已经成功应用于促进ACL重建移植物的愈合、腘绳肌拉伤、半月板损伤、肘关节侧副韧带损伤以及肩袖损伤的愈合等[5]。此外，温度敏感的水凝胶——单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸嵌段共聚物[poly（ethylene glycol）monomethyl ether and poly（lactic-co-glycolic acid），mPEGPLGA]还可以将损伤处包裹，为组织愈合提供稳定的物理环境。本研究的目的是，在大鼠模型下，探究mPEGPLGA-PRP复合体治疗ACL部分损伤的效果。

1 材料与方法

本研究已经通过我院伦理委员会审查。大鼠饲养于香港中文大学威尔斯亲王医院动物室内，采用普食喂养，术后连续3天，每天腹腔内注射0.1mg Temgesic（丁丙诺啡）止痛。在试验终点，采用过量的苯巴比妥腹腔内注射处死大鼠。截取下肢为评估使用。

1.1 实验设计

本研究采用110只12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠右侧膝关节，其中10只作为完整对照组（n=10，ACL无损伤），其余100只随机分为2组：损伤对照组（n=60，ACL部分损伤后用生理盐水处理损伤部位）、实验组（n=40，ACL部分损伤后将mPEG-PLGA-PRP复合体注射于损伤部位）。损伤对照组在手术后即刻，术后2周、术后6周进行生物力学和组织学评估，实验组在术后2周、术后6周进行生物力学和组织学评估。每个时间点的样本量为20。10例完整对照组仅进行生物力学测试。

1.2 mPEG-PLGA-PRP复合体的制备

取适量mPEG-PLGA共聚物，将其溶于1*PBS缓冲液中，使其质量浓度为25%。将溶液充分混合置于4℃的环境下重构14天，此后继续置于4℃环境中备用。

用毛细玻璃管从大鼠眼后静脉窦取血3 ml，滴入备有300 μl枸橼酸的试管中。将上述混合物，以2100 G的速度，在22℃的温度下，离心3分钟。离心后，取上清液300 μl加入到另一试管中。将该上清液以4150 G的速度，22℃的温度下，离心6分钟。离心后，将上清液全部抽出后，取100 μl再回加到试管中，并与沉淀物小心进行混合，该混合物即为PRP。

手术前，取100 μl m PEG-PLGA溶液在4℃环境下与100 μl PRP混合，并加入10 μl 10%氯化钙作为激活剂，用注射器抽取mPEG-PLGA-PRP复合体备用，本复合体中mPEG-PLGA浓度11.9%，PRP的血小板浓度理论上为全血中浓度的4.8倍。

根据Peng等[6]的研究，在11.9%的浓度下，mPEGPLGA水凝胶的凝固温度约为36℃，即在4℃的温度下该水凝胶为液态，而在接近大鼠体温的36℃下，该水凝胶可以在2分钟内凝固为胶体，达到包裹损伤部位的目的。

1.3 手术步骤

沿大鼠膝关节内侧切一长约1.5 cm切口，逐层切开，直至切开关节囊。清理膝关节前方滑膜及髌下脂肪垫，以暴露ACL全长及其股骨止点。取以30G注射器针头，在ACL股骨止点处，以垂直于ACL走行的方向穿刺ACL一次。本模型建立方法已经通过预实验病理学切片证实可以造成ACL部分损伤（图1）。

将实验动物转入4℃冷室中，用注射器在损伤处注射0.1 ml mPEG-PLGA-PRP复合体（实验组），或0.1 ml生理盐水（生理盐水对照组）。将实验动物转入手术室，待mPEG-PLGA-PRP凝固后逐层缝合伤口。

1.4 评估、测试方法

损伤对照组在术后即刻、术后2周、术后6周，分别取10例样本进行HE染色观察形态和细胞分布，并由两名作者根据Murray等[7]的韧带成熟指数表进行评分，取二者评分的平均值作为最后得分，分别取10例样本采用MTS-850力学测试机（Biodex，USA）以60 mm/分钟的速度，以最大250 N的力进行拉断试验，记录拉断强度，计算韧度。实验组在术后2周、术后6周，分别取20例样本，采用上述方法进行组织学（10例）和生物力学评估（10例）。

1.5 统计学处理方法

本研究采用 SPSS 16.0（SPSS Inc，Chicago，USA）进行统计学分析。对统计学评分，采用非参数 Mann-Whitney U检验比较不同时间点和不同分组间的差异。使用Kolmogorov-Smirnov检验检测是否符合正态分布，拉断强度和韧度使用ANOVA检验和 post hoc Turkey’s HSD检验比较不同时间点和不同分组间的差异。P＜0.05定为有显着性差异。

2 结果

2.1 组织学结果

损伤对照组：手术后即刻，ACL部分损伤位于其股骨止点附近，在损伤部位，ACL的纤维走行被明显切断。术后2周，损伤部位附近出现炎症细胞和红细胞，未见纤维组织增生和新生血管，部分ACL部分损伤发展为完全损伤。术后6周，ACL完全损伤两断端进一步退缩，部分韧带组织被吸收，断端细胞数量减少，坏死增加，未见纤维组织增生和新生血管。见图2。

实验组：术后2周，损伤部位附近出现分叶核细胞和红细胞，未见纤维组织增生，有新生血管形成，ACL损伤部位纤维走行不连续。术后6周，ACL损伤已出现部分愈合，炎性细胞减少，出现新生纤维组织，但走行与正常ACL组织仍有差异，可见新生血管形成。见图3。

图3 实验组组织学结果（10×）

韧带组织成熟度评分见表1。术后2周实验组的评分与损伤对照组的差异没有统计学意义，术后6周实验组的评分高于损伤对照组，差异有统计学意义。

表1 韧带组织成熟度评分结果

2.2 生物力学结果

生物力学结果见表2。

表2 生物力学拉断强度（N）

3 讨论

本研究最重要的发现是mPEG-PLGA-PRP复合体在大鼠模型下治疗ACL部分损伤，术后6周在组织学与生物力学方面与对照组相比均有显着改善，但是尚未恢复到损伤前的水平。

既往有少量文献针对ACL部分损伤的愈合进行过研究。Kondo等[8]采用“拉长型ACL部分损伤”模型，该模型将ACL近、远1/3各切断一半，即在前向应力的作用下，ACL会拉长，然后在损伤处加入4 ng转化生长因子β1与血纤蛋白粘合剂，术后12周发现，该组ACL的拉断强度和韧度均显着高于各对照组。Murray等[7]采用胶原-PRP水凝胶，在中1/3 ACL部分损伤模型下，进行治疗，结果发现，术后6周，与对照组MCL的愈合相比，实验组有类似的细胞填充，同时有相似的蛋白表达谱。Kanaya等[9]将ACL在体部的位置切断1/2，后采用间充质干细胞注射于损伤部位，术后4周发现组织学愈合迹象，即纤维细胞形成，细胞种类以成纤维细胞为主，组织学评分较未治疗组有显着提高。生物力学拉断强度较对照组也有显着改善。Oe等[10]在采用骨髓细胞注射到ACL部分损伤部位，术后4周发现，与未治疗组相比，转化生长因子β1的表达显着增加，同时在损伤部位出现了更多的成熟梭形细胞。尽管上述研究与本研究采用的促愈合介质不同，但是均获得了满意的治疗效果，其结果与本研究一致。

流行病学研究发现，人类ACL部分损伤最常见的部位是在股骨止点附近，但是，既往研究的动物模型并没有很好地模仿人类ACL部分损伤的常见形态[11]。而本研究采用直径为0.3 mm的注射器针头垂直穿刺ACL股骨止点位置，这样做的好处有以下几点：首先，与既往研究使用刀直接切割制造损伤相比，穿刺的大小可控，即可重复性高；第二，大鼠ACL直径约为1.0 mm，注射器针头制造的损伤大小符合ACL部分损伤的诊断标准；第三，穿刺的位置也与常见的人类ACL部分损伤位置相同。

由于目前的ACL重建术需要取自体腘绳肌健或髌腱作为移植物，同时还需要钻取骨隧道，所以手术创伤较大。但是ACL自身的愈合能力有限，在自然条件下难以愈合，ACL重建术仍是治疗的金标准。PRP已经成功应用于促进ACL重建移植物的愈合、腘绳肌拉伤、半月板损伤、肘关节侧副韧带损伤以及肩袖损伤的愈合等[5]。本研究采用PRP作为促愈合介质之一。为了应对物理因素，根据Peng等[6]的研究，我们采用一种温度敏感的水凝胶作为另一介质与PRP混合形成复合体。它可以在体温下从液态变为固态，将ACL损伤部位包裹，与关节液有效隔离。

本研究的局限性如下：首先，动物实验的结果无法替代人类的实验结果；其次，本研究没有加入水凝胶对照组，因此实验结果无法完全排除水凝胶对于ACL部分损伤愈合的促进作用；第三，本研究最长随访时间为6周，实验组尚未恢复到与正常状态持平，因此可以在将来的研究中考虑延长随访时间。

本研究的临床意义有以下几点：首先，PRP的原料为自体血，临床上易得，PRP的制备过程也比较简单，手术室条件下的可操作性强；第二，mPEG-PLGA水凝胶可以置于注射器中，需要时可在关节镜监视下，从操作入路注射到损伤部位，短时间内即可固化；第三，该复合体治疗ACL部分损伤所需时间较手术短，创伤较小。

本研究的结论是mPEG-PLGA-PRP复合体在大鼠模型下治疗ACL部分损伤，术后6周在组织学与生物力学方面与对照组相比均有显着改善，但是尚未恢复到损伤前的水平。