负重爬梯运动调节去卵巢大鼠OPG/Ikkα/Runx2基因表达以及对股骨结构和生物力学的影响

刘晨涛 张娟娟 苗华 孙丽君 唐量

1 西北大学体育教研部（西安710127）

2 陕西师范大学生命科学学院

3 陕西师范大学体育学院

衰老通常与肌肉质量和骨矿物质密度降低有关[1]。这种衰老所致的肌肉萎缩和虚弱可能导致力量下降[2]。骨密度（bone mineral density，BMD）降低是自发性骨折的常见原因，在激素缺乏的老年妇女中，也是发生骨质疏松症的重要信号[3，4]。在骨骼生长期，激素分泌物与适当的运动刺激相结合，有可能显着提高峰值骨量；在生长期间增加峰值骨量可以帮助延缓发病，减轻严重程度，或预防老年人骨质疏松症[5]。目前研究表明，高冲击活动（例如跳跃）或负重力量训练已被推广为提高骨矿物质密度的有效运动刺激[6-9]。此外，低负荷高重复阻力训练已被证明可以改善老年人群的最大力量、平衡和功能任务表现[10，11]。研究发现，与低负荷训练干预相比，使用超过75%～80%最大重复训练负荷的高强度（或高负荷）训练干预，在改善BMD方面更为成功[12，13]。值得注意的是，当训练量相当时，低负荷和高负荷训练在提高骨密度方面可能同样有效[14]。因此，低负荷高重复的阻力训练可以作为中老年人高负荷阻力训练的替代方案。阻力训练经常与高冲击或负重运动相结合，以增强对BMD 的有益作用。因此，为中老年人群开发有效的锻炼方案需要准确理解体育锻炼与骨形成和再吸收之间的相互作用。

运动干预对老年女性骨代谢有益[15]。因此，与运动相关的骨矿物质密度改善可能是治疗与年龄相关的骨质疏松症的非药物策略。骨代谢受多种局部因素影响，包括核因子κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK）及其配体（receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）细胞因子系统、炎性细胞因子、生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、前列腺素、集落刺激因子和白细胞介素[16，17]。骨重建过程中产生的一些物质是骨代谢的特定生化标志物。碱性磷酸酶是与细胞膜结合的普遍存在的四聚体酶[18]。在骨中，骨特异性碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）存在于成骨细胞的表面，并在类骨质生成和矿化中起重要作用[19，20]。骨代谢的改变往往发生在骨量、骨密度和骨超微结构发生改变前后。卜淑敏等[21]发现进行8 周的全身垂直振动训练能显着增加去卵巢大鼠股骨远端松质骨的体积骨密度、骨体积分数和骨小梁数目。此外，有研究发现，负重爬梯能够增加股骨头松质骨的矿物质密度和骨小梁数量，减小骨组织分离度，抑制骨组织的流失与保护骨组织微结构，但对骨组织最大载荷和能量吸收等力学特性没有显着影响[22]。张林研究指出运动对骨结构力学和骨材料力学性能具有良好的刺激作用[23]。

去卵巢大鼠是一种有效的动物模型，能够模仿绝经后症状，如骨质疏松症、肌肉减少症和代谢综合征[24-26]。研究显示，大鼠负重爬梯训练有效模仿了力量训练[27-30]，给机体承重骨更大的应力刺激，有助于骨形成，对改善肌肉力量、骨微结构和生物力学特征等效果显着[31]，但对雌激素缺乏情况对机体机能水平影响的研究较少。因此，本研究中，我们对去卵巢大鼠进行负重爬梯运动干预，观察其对骨骼健康的影响，并对其作用机制进行探究，旨在为骨质疏松等疾病的预防提供参考依据。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物

健康3月龄雌性SD大鼠30只，购于西安交通大学医学院实验动物中心（陕医动证字：08-004 号），体重263.23 ± 10.68 g。大鼠分笼饲养在室内温度为23 ±3℃，湿度为45% ± 5%的环境中，昼夜比为12∶12，自由饮水摄食，食物为国家标准啮齿动物饲料（GB14924.3-2010）。

1.2 动物建模、分组与训练

大鼠禁食12 h 后，记录每只大鼠初始体重，腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉，剂量为50 mg/kg，行背侧双切口手术去卵巢并结扎缝合。去卵巢组进行卵巢摘除，假手术组（CON）只将卵巢旁同体积脂肪切除，手术后动物无感染，全部存活。术后将去卵巢组大鼠再随机分为2 组，即去卵巢手术组（OVX）和去卵巢负重爬梯运动组（OVX-CL）。去卵巢负重爬梯运动组大鼠于术后适应性饲养1 周后进行爬梯训练，训练前分别记录各组大鼠干预前体重。参照Fleck 等[32，33]的研究确定训练为小负荷大运动量，即进行自身体重15%重量的负重爬梯，每天10 组，每组循环3 次，组间间歇2 分钟，每周训练6天，持续8周，前3天为无负重的适应性训练。爬梯高1 m，每级梯阶相隔2 cm；爬梯倾斜角为85°。

1.3 实验组织样品收集

8 周训练结束后，于最后一次训练完24 h 后取材。记录各组大鼠干预后体重，断颈椎处死，断头取血5 ml，37℃水浴15 min后，低温离心机3500 rpm/min离心10 min，取上层血清放置于—80℃低温冰箱待测。取两侧股骨，去除骨上附着的软组织，左侧股骨用浸过生理盐水的纱布包裹放入—20℃冰箱待测，右侧股骨在液氮速冻24 h后转移至—80℃冰箱中待测。

1.4 血清生化指标检测

在无菌环境下分别对已制备的血清中磷（phosphorus，P）（南京建成有限公司）、钙（calcium，Ca）（南京建成有限公司）、ALP（南京建成有限公司）、抗酒石酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，StraCP）（南京建成有限公司）、RANKL（R&D Systems，Inc）以及OPG（Abnova，Inc）采用酶联免疫试剂盒检测，所有的操作步骤与流程均严格按照出厂试剂盒说明书进行，并根据试剂盒上相应的公式与测出的光度值计算出所对应的值。

1.5 qRT-PCR

所提取RNA 的骨组织样品部位是距离股骨生长板1 cm 处整段股骨，采用TRIzol 裂解液（TaKaRa，大连）依据说明书进行。qRT-PCR 反应体系与反应程序按照实验室之前研究进行[34]。引物参照Genbank 数据库序列采用在线引物设计软件Primer 3 plus进行设计（表1），由上海生工合成。以GAPDH作为内参基因，根据F=2-△△Ct计算各基因的相对表达量[35]，每个样品分别进行3个生物学重复和3个技术重复。

表1 目标基因引物序列

1.6 Micro-CT扫描

使用中国科学院与西安电子科技大学共同研发的Micro-CT 扫描系统（ZKKS-MCT-Sharp），股骨样品在室温融化后用于Micro-CT 扫描，参数设置电压为50 kV，电流大小为1 mA，进行360o扫描，角度增益为0.36o，曝光时间为250 ms，扫描分辨率为35 μm*35 μm*35 μm，将扫描后的PRJ 数据导入MedProject 软件进行二次重建得到IM0文件，将IM0文件进行三维重建后转换为RAW格式文件，用3DMed软件对感兴趣区域进行处理分析，位置选取距股骨生长板远端60个片段（2.1 mm），设置分割阈值为峰值区域，对其进行可视化成像，并得出骨微结构相关数据：骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、松质骨矿密度（BMDtrab）、皮质骨矿密度（BMDcort）、骨体积分数（BV/TV）、结构模型指数（SMI）。

1.7 生物力学测定

本研究使用材料测试系统（MTS-858，USA）进行三点弯曲试验，股骨样品在室温融化后，置于间距为20 mm 的水平支架上，载荷施加速度为2 mm/min 直至骨折发生，测试结束后于断裂处用游标卡尺测量股骨外侧长轴（a，mm）、短轴（b，mm）以及股骨横截面皮质骨的均值（t，mm），参考相关文献[36]求得弹性模量（MOE），并借助软件Origin 9依次得出最大载荷（ML）、刚度（Stiffness）及吸收的总能量（EAC）。

1.8 统计学分析

实验数据均采用SPSS17.0 统计软件进行处理，结果以平均数± 标准差（±s）表示。组间差异显着性采用方差分析的Tukey HSD（One-Way ANOVA），显着性水平选择P＜0.05 和P＜0.01，GraphPad Prism 5.0 软件作图。

2 结果

2.1 负重爬梯运动对大鼠体重变化的影响

如表2所示，在实验初期以及运动干预前，大鼠各组间体重均没有显着性差异。与CON 组相比，8 周实验干预后OVX 组大鼠和OVX-CL 组大鼠体重均升高（P＜0.01）；OVX-CL组大鼠较OVX组大鼠体重下降（P＜0.01）。

表2 各组大鼠体重比较（单位：g）

2.2 负重爬梯运动对血清标志物的影响

如表3 所示，与CON 组大鼠相比，8 周实验干预后OVX 组大鼠血液中的ALP、OPG 均下降（P＜0.01），RANKL 升高（P＜0.01），OPG/RANKL 的比值也下降（P＜0.01）；与OVX 组大鼠相比，经过8 周负重爬梯运动干预后，OVX-CL 组大鼠Ca 和RANKL 降低（P＜0.05），ALP以及OPG/RANKL的比值均升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清标志物水平比较

2.3 负重爬梯运动对股骨骨代谢指标及NF-κB信号通路基因表达的影响

如图1所示，与CON组大鼠相比，OVX组大鼠骨组织中OPG、Runx2 基因表达降低（P＜0.01），RANKL、Ikkα和NF-κB的基因表达水平升高（P＜0.01）。与OVX组大鼠相比，8 周负重爬梯运动干预后，OVX-CL组大鼠股骨中RANKL、Ikkα以及NFκB2 基因表达量下降（P＜0.05）；OPG和Runx2基因表达量增加（P＜0.01）。

图1 负重爬梯运动干预后股骨骨代谢指标及NF-κB信号通路基因表达量变化

2.4 负重爬梯运动对股骨微结构的影响

如表4 和图2 所示，与CON 组大鼠比较，8 周实验干预后，OVX 组大鼠股骨Tb.N（P＜0.01）、Tb.Th（P＜0.05）、BMDtrab（P＜0.01）和BMDcort（P＜0.01）均下降，Tb.Sp 和SMI 均升高（P＜0.01）；OVX-CL 组大鼠股骨Tb.N（P＜0.05）、BMDtrab（P＜0.01）和BMDcort（P＜0.05）均下降，Tb.Sp 和SMI 均升高（P＜0.01）。与OVX 组大鼠相比，8周负重爬梯运动干预后，OVX-CL 组大鼠股骨Tb.N 、BMDtrab均升高（P＜0.05），Tb.Sp和SMI均降低（P＜0.05）；BV/TV虽然有所下降，但各组间差异均无统计学意义。

表4 各组大鼠股骨微结构参数比较

图2 大鼠股骨松质骨三维结构（标尺单位：0.35 mm）

2.5 负重爬梯运动对股骨生物力学特性的影响

如表5所示，与CON组大鼠相比，OVX组的ML（P＜0.01）、Stiffness（P＜0.05）、EAC（P＜0.01）以及MOE（P＜0.05）均下降；与OVX 组大鼠相比，经过8 周负重爬梯训练后，OVX-CL 组大鼠的力学特征均呈现出明显改善，主要体现在ML以及Stiffness均增加（P＜0.05）。

表5 各组大鼠股骨生物力学特性指标比较

3 讨论

尽管已有研究表明，诸多以跑为主要形式的有氧运动干预能够改善骨质疏松，但是负重爬梯作为一种以无氧供能运动方式为主，模拟攀登的高强度抗阻力训练，对骨质疏松干预效果的报道仍较匮乏。本研究设计了负重爬梯运动对去卵巢大鼠骨质疏松模型干预的实验，探讨负重爬梯运动通过调控OPG/Ikkα/Runx2基因表达对去卵巢大鼠股骨的骨微结构生物力学特性的影响。

骨生成与骨吸收的调节机制如Dufresne 等的研究[55]所示，骨重塑的过程主要取决于成骨细胞表达OPG及RANKL 的多少，RANKL 是成骨细胞、淋巴细胞和骨髓细胞的产物，是破骨细胞生成最强大的刺激物[17]。它通过与破骨细胞祖细胞表面上的RANK 结合，并刺激它们向成熟破骨细胞分化而发挥其活性。OPG阻断RANKL 与RANK 的结合，并通过抑制破骨细胞分化来调节骨吸收[37]。血清中RANKL 与OPG 的变化更能反映出骨转换的状态，且OPG/RANKL表达的比例被认为是破骨细胞形成活性的关键决定因素。OVX组大鼠血清中RANKL水平均显着升高，血清中OPG水平显着降低，OPG 不足以螯合所有的RANKL，说明破骨细胞引起的骨吸收活动增强；OPG与RANKL的比值降低也说明了骨重建与骨吸收的动态平衡产生明显迁移。在骨组织中我们发现RANKL mRNA 表达水平显着升高，OPG 的表达有所降低但不明显，这说明此时的骨组织已发生骨质疏松。基因表达的差异性会使循环系统中RANKL 和OPG 的含量发生变化进而起到调控作用。去卵巢大鼠进行负重爬梯训练后，我们发现运动同时增加血清和骨组织中OPG的表达并降低RANKL表达，表明运动通过增加OPG/RANKL 比例抑制破骨细胞分化，进而预防骨质疏松的发生。诸多报道[38，39]指出运动训练通过对OPG 与RANKL 表达量的调节对骨健康产生调控作用，与本研究结果一致。

Runx2 是成骨细胞分化和骨形成的关键转录因子。有研究表明，许多成骨分化过程的转录因子都会靶向Runx2 基因，其中有Wnt 通路、BMP/MAPK 通路、FGF/ERK 通路、TGF-β/Smad 通路等，从而对成骨基因的表达进行调节[40]。作为成骨细胞重要来源的间充质干细胞在向成熟的成骨细胞分化的过程中，Runx2也起着至关重要的作用[41]。研究发现，通过卵巢切除术诱导骨质疏松症，NF-κB在转基因小鼠IKKα显性失活突变体中显着降低，因此Ikkα可抑制成骨细胞谱系细胞中的NF-κB[42]。Notomi等[43]发现，对大鼠进行抗阻力训练能够通过提升Runx2 的表达水平降低RANKL/OPG的比值，从而调控骨的生长。Stringhetta 等[44]也报道运动训练使Runx2 的表达量增多，对成骨细胞生成及对破骨细胞的抑制也有明显作用。在本研究中，我们也发现与假手术组相比，OVX 组大鼠骨组织中Runx2 表达显着降低，Ikkα和NF-κB的表达水平显着升高；而在进行负重爬梯训练后，Runx2 的表达显着升高，Ikkα和NF-κB 的表达显着降低，这些结果表明负重爬梯运动可以通过抑制Ikkα表达量，进而减少NFκB 表达量，增加Runx2 的表达可实现促进骨生成的作用。Pacios 等[45]在细胞水平上报道了RANKL/Ikkα/NFκB的负调控作用。Khedgikar 等[46]也在小鼠实验中报道了NFκB/Runx2对股骨成骨细胞和破骨细胞的调控作用。因此，本研究进一步证实了负重爬梯训练可通过调控OPG/Ikkα/NFκB2/Runx2的表达改善去卵巢大鼠骨质疏松的微结构并对力学特性有积极作用。

在本研究中我们还发现两组去卵巢大鼠体重快速增加，8 周干预后OVX-CL 组较OVX 组大鼠体重显着降低，这表明负重爬梯运动作为一种有效的干预手段可降低体内由于雌激素减少造成的代谢失常而诱发体重增加。血清中的Ca、P、ALP、StraCP、RANKL、OPG等都是与骨组织变化相关的生化标志物[47]。ALP 是骨形成的早期标志物，StraCP 可用于评估破骨细胞活性。本研究结果显示大鼠去卵巢后，ALP水平显着降低，而进行负重爬梯训练后，ALP的水平显着升高，表明去卵巢影响了骨的形成，而负重爬梯训练能够刺激骨形成。此外，P和StraCP在不同组大鼠血清中的水平均无明显变化，而Ca 仅在OVX-CL 组大鼠血清中显着增加，进一步证实了负重爬梯训练刺激骨生成的作用。

BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp 和Tb.N 是描述骨小梁微结构的重要参数。据报道，BV/TV[48]、BMD[49，50]、Tb.N[51]和Tb.Th[52]增加对骨质有积极作用。在本研究中，我们观察到在去卵巢手术组中，除BV/TV以外，骨的超微结构参数与对照组相比均显着下降，减弱了骨的力学特性。负重爬梯训练后骨微观结构特性显着改善，如图2所示，负重爬梯运动组骨量增加，骨小梁更丰富。Tb.N、BMDtrab的增加和Tb.Sp、SMI 降低证明了这一点，而Tb.Th没有明显改善，这可能是由于外界刺激对骨小梁厚度变化影响的速度较慢，一定时间段内更多的是通过BMD 及骨小梁数量改善骨的特征。Micro-CT 扫描结果表明，负重爬梯训练可以改善去卵巢对骨小梁和微结构的消极作用。骨的生物力学性质和微观结构参数密切相关，包括骨密度在内的骨微观结构可影响骨的生物力学特性[53，54]。本研究中，8周的负重爬梯训练显着提高了最大载荷和刚度，而最大载荷和刚度又是避免骨折发生的先决条件。此外，相关分析结果显示，生物力学性能与骨的微观结构参数密切相关，这支持了以往的结论，即微观结构参数可用于预测骨小梁的生物力学特性[53]。

4 结论

综上所述，8周的负重爬梯运动对预防去卵巢大鼠骨质疏松有着积极效果。本研究表明通过负重爬梯运动对OPG/RANKL 以及Ikkα/NFκB2/Runx2 的基因表达调控能够改善成骨与破骨之间的平衡状态，对改善骨的超微结构、骨的生物力学特征等均有积极作用，从而为提高骨的健康状态，阐明骨生长的机制提供参考依据。此外，由于血清中指标较易检测，并且在一定灵敏度范围内可以反映骨组织内部的表达情况，故可以考虑将血清中OPG、RANKL、Runx2的标志物含量作为骨质疏松症辅助检测的简易指标之一。