长期大强度运动后心肌NFκB和ICAM-1的变化及其在运动性心肌纤维化中的作用

饶志坚 郑莉芳 常芸 于涛 史仍飞

1 上海师范大学体育学院（上海200234）

2 上海体育学院运动科学学院（上海200438）

3 国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

适宜的规律性运动有益于身心健康，尤其有利于心血管疾病的预防与治疗。然而，近些年来研究表明运动量与健康风险之间的关系并不是线性的而是呈U型曲线[1]，即长期大强度运动可能对人体带来不利的影响，且心脏可能是易损器官，长期大强度运动可诱发房颤、心肌纤维化、致心律失常性右心室心肌病和心源性猝死等[2]。我们及其他课题组动物研究发现长期大强度运动后右心室和心房出现心肌纤维化[3-6]，同时文献报道在运动员身上也检测出了心肌纤维化[7，8]。

然而，目前关于运动性心肌纤维化的报道主要是观察性研究，很少对其机制进行探索，但多项研究表明运动性心肌纤维化与运动量之间存在一种剂量反应的关系。如La Gerche等[9]报道出现心肌纤维化的运动员参加耐力运动年限（平均20年）比未出现心肌纤维化的运动员（平均8年）要长。相似地，Wilson 等[8]发现核磁共振钆剂延迟增强（late gadolinium enhancement，LGE）的出现与运动年限、完成的马拉松或超级马拉松次数有关。Möhlenkamp等[10]也证实完成马拉松的次数与LGE有一定的关联。案例报道也证实被查出有心肌纤维化的运动员大都有多年大强度运动的经历，比如，一名运动员每周运动10 小时，包括50 km 的跑步和1～2 小时的山地自行车骑行[11]，而另一个运动员每年骑行23000 km持续了14年[12]。Wilson等[8]发现老运动员出现心肌纤维化的概率最高，达到50%，这些老运动员平均受训年数为43年；而年轻运动员或缺乏运动训练的人并未检测出心肌纤维化。我们之前也报道过长期大强度运动会引起右心室纤维化，但中强度运动未检测出[4，13]。

心肌纤维化的发生通常与炎症有关[14，15]，长期大强度是否会引起心肌炎症？我们前期研究发现一次力竭运动和反复力竭运动都可以引起炎症浸润到心肌细胞和心脏传导系统，进而引起心律失常的发生[16-19，20]。尽管一次大强度运动对心脏的影响可能没有一次力竭运动的影响大，但长期反复大强度运动可能会导致心肌细胞微损伤的积累，从而导致比较严重的后果，比如炎症和心肌纤维化。之前，Aschar-Sobbi 等[21]已报道6周大强度游泳或跑台运动可引起心房肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）表达升高，从而增加房颤的易感性。我们也报道了长期大强度运动后左、右心室心肌单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和白细胞介素1 β（interleukin-1β，IL-1β）表达水平升高，且这些炎症因子可能是运动性心肌纤维化发生的关键因子[13]。NFκB 是调节炎症反应的核心因子之一，能刺激多种炎症细胞和组织细胞分泌促炎因子[22]；而ICAM-1是一种细胞间粘附因子，它可使炎症细胞穿过血管壁并辅助炎症细胞游走到组织的病灶[23]。然而，长期大强度运动后这两个因子的变化及其在运动性心肌纤维化中的作用还未见报道。

鉴于此，本研究观察长期大强度运动后心肌NFκB和ICAM-1 的变化，探寻长期大强度运动后心肌NFκB和ICAM-1 在mRNA 和蛋白水平的表达规律及其在运动性心肌微损伤和心肌纤维化发生中的作用，为运动性心肌纤维化发生机制的研究提供理论与实验依据，为运动性心肌纤维化的治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验对象

72只8周龄雄性SD大鼠，体重220 ± 8 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均以啮齿类动物普通饲料喂养，饲养于国家体育总局体育科学研究所ABSL-3级动物房，室温为20°C～25°C，相对湿度为55%～70%，饲养室昼夜循环为12/12（7:00～19:00）。

1.2 分组与运动方案

所有大鼠适应性喂养3天后，进行1周的适应性跑台训练，15 min/天，速度为15 m/min。随后将大鼠随机分为安静对照组（Sed组，n＝24）、中强度运动组（ME组，n＝24）和大强度运动组（IE组，n＝24），每组按照训练周期的长短又分为8 周、12 周和16 周。运动强度参照Bedford 方案，中强度组为：速度15.2 m/min，坡度5°（约等于58.4% ± 1.7% VO2max）；大强度组为：坡度10°，先以15 m／min 的速度跑5 min，然后在随后的5 min 内逐渐增到28 m/min（约等于 81.0% ± 3.5%VO2max，相当于人类85%最大心率的运动，自感劳累分级中感觉费力RPE指数15）。运动频率为5天/周，1次/天，1小时/次。安静对照组大鼠自由活动。

1.3 取材

各组在训练8周、12周和16周运动结束后24小时后分别进行取材，每组8 只。麻醉后快速分离心脏取左、右心室，一部分石蜡包埋用于HE 染色和天狼星红染色，一部分－80℃保存用于Western blot 蛋白检测和RT-PCR。

1.4 HE染色和天狼星红染色

HE 染色和天狼星红染色参考本课题组之前的方案[4，13]。

1.5 Western blot检测蛋白表达水平

取100 mg左右的心肌组织加入1 ml的RIPA细胞裂解液（碧云天）中，然后采用组织匀浆机进行匀浆，匀浆后静置于冰上30 分钟，再以12000 转/分的转速4 度离心，取上清后采用BCA 试剂盒（碧云天）检测蛋白浓度。将蛋白浓度调为一致后加入上样缓冲液，然后置于水浴锅中水浴7 min（95℃），用于电泳或－20℃保存。蛋白样本经电泳、转膜、封闭后，一抗孵育过夜，包括GAPDH（1 ∶5000）、NFκB（1 ∶1000）、IκB（1 ∶1000）、ICAM-1（1∶1000），所有一抗均购自Abcam。第2 天室温孵育二抗2 小时，TBST 清洗3 次，每次5 分钟，然后采用成像仪进行成像（伯乐）。得到的图像采用Image J 读取灰度值。

1.6 RT-PCR检测基因表达水平

采用Trizol 法提取左、右心室总RNA，采用TAKARA 公司的反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit），按操作说明书添加试剂，然后37℃反应15 min，之后85℃反应5 s以使酶失活，得到的cDNA用于后面的荧光定量。荧光定量采用TAKARA 公司的SYBR Premix Ex Taq，以GAPDH 为内参，按操作说明书添加试剂，引物信息见表1，反应条件为预变性90℃30s，PCR反应40个循环95℃5 s、60℃31 s。得到的数据采用2-ΔΔCt的方法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物信息

1.7 数据统计与分析

所有数据用SPSS 22.0进行分析处理，数据用平均值±标准差表示，同一时间点组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。采用GraphPad Prism 6.0作图。

2 结果

2.1 长期大强度运动后右心室出现炎症细胞的浸润和纤维化

我们之前已经报道长期大强度运动后，右心室出现炎症细胞的浸润，而左心室没有（HE 染色，图1）；且右心室出现心肌纤维化，左心室未观察到胶原的堆积（天狼星红染色，图2）。

2.2 长期大强度运动后心室NFκB/IκB的变化

2.2.1 长期大强度运动后左心室NFκB/IκB的变化

8周（P＜0.05）、12周（P＜0.05）和16周（P＜0.05）大强度运动后左心室NFκB/IκB mRNA 表达水平的比值显着低于对照组；16 周大强度运动后左心室NFκB/IκB mRNA 表达水平显着低于中强度运动组（P＜0.05）。左心室NFκB/IκB 蛋白表达水平在各个时间点的各组间没有显着性差异。

2.2.2 长期大强度运动后右心室NFκB/IκB的变化

8 周中强度（P＜0.01）和大强度（P＜0.01）运动后右心室NFκB/IκB mRNA的比值显着低于对照组，中强度组和大强度组之间没有显着性差异。12 周各组间NFκB/IκB mRNA 表达水平没有显着性差异。16 周大强度运动后右心室NFκB/IκB mRNA 的比值显着高于对照组（P＜0.05）。8周（P＜0.05）、12周（P＜0.05）和16周（P＜0.05）大强度运动后右心室NFκB/IκB 蛋白表达水平显着高于安静对照组，中强度组与安静组没有显着性差异。

图1 左右心室HE染色（引自Rao[13]）

图2 左右心室天狼星红染色（引自Rao[13]和饶志坚[4]）

图3 左心室NFκB/IκB基因（A）和蛋白（B）相对表达量的变化

图4 右心室NFκB/IκB基因（A）和蛋白（B）相对表达量的变化

2.3 长期大强度运动后心室ICAM-1的变化

2.3.1 长期大强度运动后左心室ICAM-1的变化

8 周中强度运动后左心室ICAM-1 mRNA 的表达水平显着高于对照组（P＜0.05）和大强度运动组（P＜0.05），而大强度运动组与对照组没有显着性差异。12周和16周各组间左心室ICAM-1 mRNA表达水平没有显着性差异。左心室ICAM-1 蛋白表达水平在各个时间点的各组间没有显着性差异。

图5 左心室ICAM-1基因（A）和蛋白（B）相对表达量的变化

2.3.2 长期大强度运动后右心室ICAM-1的变化

16周大强度运动后右心室ICAM-1 mRNA的表达水平显着高于安静对照组（P＜0.05），而8 周和12 周各组间没有显着性差异。16周大强度运动后ICAM-1蛋白表达水平显着高于安静对照组（P＜0.01）和中强度运动组（P＜0.05），而8周和12周各组间没有显着性差异。

图6 右心室ICAM-1基因（A）和蛋白（B）相对表达量的变化

3 分析与讨论

运动性心肌纤维化的发生已经在人体和动物实验中被证实[4，6-8]，但是其机制仍不清楚。我们前期实验发现长期大强度运动后大鼠血清中心肌损伤标志物cTnI显着性升高[13]，但目前对这种现象的解释仍不一致[24-26]。有学者认为这是大强度运动后心脏的适应性生理变化，类似于骨骼肌，损伤后重塑可使心肌细胞获得更大的收缩能力；然而，另有研究认为这是一种病理性变化，心肌损伤标志物的升高代表大强度运动后心肌细胞发生了微损伤，长期进行大强度运动则会导致这种微损伤累积，进而诱发炎症和其他不良的变化。考虑到心肌细胞并没有骨骼肌那样强的再生能力，我们认为后一种更接近事实。

长期大强度运动引起的心肌损伤可能是多因素的，如氧化应激损伤和机械应力损伤。我们之前的研究就发现长期大强度运动后大鼠血清SOD 水平下降，而MDA水平上升，表明大鼠体内氧化应激水平升高[27]，其他课题组进一步研究发现长期大强度运动后氧化应激同样发生在心肌细胞中[28]，但他们并未区分氧化应激的部位（左心室还是右心室）。因此，这种情况下氧化应激损伤并不能解释为什么只有右心室出现了炎症和心肌纤维化，而左心室未出现异常变化。而之前有研究指出[29]，与安静状态相比，大强度运动时右心室压力增加了125%，而左心室压力只增加了14%。近年一项研究[30]发现大强度运动后心室应变的下降（表明功能下降）主要发生在右心室；而左心室应变的下降主要发生在室间隔，而且很可能是由右心室功能障碍引起的。这些结果解释了为什么大强度运动后右心室更容易受到损伤，损伤后则可出现炎症反应和心肌纤维化。确实，我们之前就已经报道了长期大强度运动后右心室MCP-1 和IL-1β表达水平升高，且右心室出现心肌纤维化；而左心室中MCP-1 和IL-1β表达水平则未发生变化，左心室中也没有发现胶原纤维的堆积[13]。因此，运动性心肌纤维化的发生可能与炎症反应密切相关。

NFκB是调控炎症反应的核心因子之一，正常情况下它与IκB 结合处于失活状态，一旦其上游通路被激活（无论是经典通路还是非经典通路），IκB蛋白则会被磷酸化，随后被水解，暴露NFκB核转录活性位点，转移到核内后调控下游炎症因子的表达[22]。可见，IκB被磷酸化能在一定程度上代表NFκB通路的激活，然而磷酸化的IκB很快就会被水解，存在时间十分短暂，因此其磷酸化水平不利于检测。而采用NFκB/IκB的比值，也能在一定程度上反映NFκB通路是否被激活，因为细胞内NFκB 总量不会发生变化（尽管会从胞浆转移到核内），而IκB 磷酸化后会被水解导致其含量下降。因此，提取全细胞蛋白后检测NFκB 和IκB 的表达水平，计算其比值，如果与对照组相比其比值升高则表明IκB磷酸化后被水解，即NFκB 被激活。本研究发现，与对照组相比，大强度运动后右心室NFκB/IκB的比值显着性升高，而左心室NFκB/IκB 的比值没有显着性变化。这表明长期大强度运动后右心室中NFκB通路被激活，进而放大炎症反应，但左心室却没有发生类似的反应。ICAM-1是一种细胞间粘附因子，它可以在多种细胞中表达，如心肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等，它的表达则受控于NFκB[23]。研究表明正常情况下，体内ICAM-1的表达处于较低水平，而当受到炎症因子的刺激后其表达水平显着升高，这一过程可能是通过NFκB调控的。本研究也发现16周大强度运动后右心室ICAM-1基因及蛋白表达水平都显着性升高，这可能是右心室NFκB激活后引起的。然而，在8周和12周时我们已经检测到右心室NFκB 的激活，这两个时相ICAM-1却未发生相应的变化。这可能是因为NFκB的激活比较迅速，而ICAM-1的上调则需要损伤的累积及炎症细胞的募集，以及其他因子刺激炎症细胞分泌炎症因子，炎症因子再进一步刺激其他细胞产生ICAM-1。结合我们前期研究发现长期大强度运动后右心室出现了心肌纤维化而左心室没有[4]，而且我们之前也检测到长期大强度运动后右心室MCP-1和IL-1β表达水平升高，而左心室未发现[13]，可见长期大强度运动对心脏造成一定的损伤，右心室是易损部位，而左心室所受影响不大，右心室损伤进而诱发炎症反应，最终导致右心室心肌纤维化。

目前很少有研究报道长期大强度运动后心脏炎症反应的情况，大多文献报道一次力竭或反复力竭运动对心肌炎症的影响。我们前期实验发现一次或反复力竭运动后心肌细胞及心脏传导系统中炎症相关因子表达升高，如NFκB、ICAM-1及TNF-α，且可能持续24小时以上[16，17，19，31]。值得指出的是，我们发现一次或反复力竭运动后无论是左心室、右心室还是室间隔中都出现炎症反应。在本研究的长期大强度运动模型中，我们只在右心室中发现炎症反应，这可能与两种运动对心脏的损害程度不同有关。力竭运动除了能对心脏造成应力损伤外，还有可能造成相对缺血缺氧及再灌注等其他损伤[32]，因此，力竭运动可能对整个心脏都造成较为严重的损伤并可能伴随心肌细胞的坏死，进而诱发多部位的急性炎症且反应较为剧烈呈爆发性。相较而言，长期大强度运动可能造成反复的心肌微损伤，在缺乏充分恢复的情况下，损伤累积后诱导一定的慢性炎症反应，多种炎症因子共同作用激活位于心肌细胞间质的成纤维细胞，促使它分泌胶原蛋白，最终导致心肌纤维化。

总之，本研究发现长期大强度运动后右心室心肌细胞中NFκB被激活且ICAM-1表达水平上调，表明长期大强度运动后右心室心肌细胞可能长期处于炎症状态，而炎症是不是运动性右心室心肌纤维化发生的病理基础尚待进一步研究。因此，今后的研究可继续探索炎症与运动性心肌纤维化之间的关系，揭示抗炎能否有效减轻运动性心肌纤维化。