基于活细胞显微技术的登革病毒膜融合实验方法的建立及初步应用

李 洁，徐元宏

(安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽合肥 230022)

登革病毒(DENV)是一种小型包膜病毒，主要通过受体介导的内吞作用以及随着病毒包膜与宿主细胞内涵体膜的融合进入细胞内复制［1]。作为包膜病毒进入细胞并将基因组释放进入细胞质所必需的步骤，病毒—细胞膜融合过程是通过一种或者多种病毒表面蛋白即融合蛋白发生构象的变化得以触发［2]。DENV与宿主细胞膜的融合是通过在内涵体酸性pH环境诱导下包膜E蛋白的结构学重排来实现的［3]。人们已经证实抑制病毒与宿主细胞膜融合是一种抗病毒中和作用机制［4]，因此深入分析抗体在虫媒病毒与宿主细胞膜融合的作用，对于理解抗体的中和作用机制至关重要。

目前，人们对抗体是否具备膜融合抑制能力的研究主要采用两种实验方法:一种是传统的膜融合抑制实验，借助显微镜观察抗体是否影响病毒—宿主细胞膜融合后合胞体的形成［5];另一种是脂质体浮选实验，用脂质体模拟病毒敏感性细胞的细胞膜，最后通过脂质体浮选对实验结果进行分析［6]。前者只能通过肉眼观察合胞体形成判断结果，要求操作者具备丰富的经验，存在一定的主观性;后者未采用活细胞，且实验步骤复杂，操作不便。以上两种实验方法均不能对抗体的膜融合抑制能力进行定量分析。因此，我们借助Incell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统建立一种基于活细胞显微技术的膜融合实验新方法，对登革病毒抗体在病毒—细胞膜融合过程中的作用进行实时、定量的分析计算，此方法同样适用其他虫媒病毒，为深入理解虫媒病毒中和作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试剂 RPMI－1640，胎牛血清 FCS，购于Invitrogen公司;96孔微量细胞培养板及购自美国Corning Life Sciences公司产品;抗体9F12、4G2为澳大利亚昆士兰大学传染病研究中心(Australian Infectious Diseases Research Centre)惠赠，其中4G2单抗是一株针对DENV融合肽(Fusion loop)的商品化交叉抗体，能够阻断病毒—细胞膜融合［7]，将此抗体作为膜融合实验的阳性对照。单抗9F12是一株针对DENV EDⅢ区的交叉中和抗体，传统的膜融合实验显示此单抗具备抑制膜融合能力［5]，我们将此单抗用于膜融合实验新方法的初步验证。

1．1．2 病毒和细胞 实验中病毒采用 DENV-2，New Guiea-C来自于南方医科大学珠江医院临床检验中心;C6/36蚊子细胞购自ATCC。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 C6/36细胞用含10%FBS、20 mol·L－1HEPES、谷酰胺的 RPMI－1640 培养基于28℃、5%CO2培养箱中进行培养、扩增。

1．2．2 确定膜融合实验介导病毒—细胞膜融合的最佳pH值 (1)用RPMI 1640生长培养基 (含有10%FBS，20 mmol·L－1HEPES 及谷酰胺)将 C6/36细胞(8×105个)接种至96孔微量培养板，置于28°C含有5%CO2的细胞培养箱过夜;(2)吸弃生长培养基后，将DENV2(MOI值为2)加入96孔板，28°C感染细胞2 h后弃去，加入RPMI 1640生长培养基进行培养(200μL);(3)孵育48 h以后，用预先调整好不同pH值的25 mmol·L－1MES(用HCl调整 pH 至5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5)的无血清RPMI－1640将4G2及阴性对照单抗进行稀释后加入细胞中(100μL)，每个稀释度重复3个复孔;(4)将细胞置于40°C孵育，同时借助 Incell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统进行连续实时监测活细胞的状态变化。

1．2．3 确定膜融合实验的最佳观察时间 pH值降低诱导病毒与宿主细胞发生膜融合以后，需要选取最佳观察时间点，如过早则融合尚未完全发生，如过迟则正常细胞形态发生变化，影响结果分析。在确定实验的最佳pH值后，进一步确定实验的最佳观察时间，实验方法同“1．2．2”，在加入低 pH 值的抗体后，将细胞置于40°C预热的Incell Analyzer 2000仪器中，设置为每隔10 min拍摄细胞状态，获取不同时间点的病毒—细胞膜融合图片数据，通过软件进行分析比较，得出最佳观察时间点。

1．2．4 膜融合实验新方法测定中和抗体9F12的膜融合抑制能力 确定基于活细胞显微技术膜融合实验的最佳实验条件后，将单抗9F12、4G2及无关阴性对照单抗进行梯度稀释，进行膜融合实验，检测抗体抑制病毒—细胞膜融合的能力，并计算半数抑制浓度IC50。

1．3 仪器 Incell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析仪，美国GE公司;CO2细胞培养箱，美国Thermo公司。

1．4 数据分析 用IN Cell investigator数据分析软件对膜融合实验结果进行定量分析，对拍摄图片上的活细胞数量进行计数，最后借助GraphPadPrism 5．0软件对所得数据进行分析。最佳pH值确定实验中，多个实验组之间的数据分析采用SPSS 13．0的单因素方差分析One Way ANOVA，多个实验组之间的两两比较采用SNK－Q检验的方法。

2 结果

2．1 膜融合实验中介导病毒—细胞膜融合的最佳p H值 虫媒病毒与宿主细胞膜的融合是通过在内涵体酸性pH环境诱导下实现的，其中pH值的下降起着关键性的作用。因此，最佳pH值的确定对于建立基于活细胞显微技术的膜融合实验新方法至关重要。pH值过高则膜融合的发生不够充分，如过低则膜融合发生过快，不利于观察及获取数据。我们通过对 5．0、5．5、6．0、6．5、7．0 这 5 个不同 pH值条件下，各实验组的膜融合现象进行观察，并定量分析，最终选取膜融合实验新方法最合适的pH值条件。如图1A所示，除pH 7．0组，其他pH值条件均诱导了不同程度的病毒—细胞膜融合发生。pH 值5．0、5．5、6．5 条件下，阳性对照及无关单抗对照组均出现了膜融合现象，活细胞数量与未感染病毒的正常细胞数量相比均显着降低(P＜0．05)，然而阳性4G2对照组与无关单抗组之间却未显示出显着差异(P＞0．05)，说明这些pH值条件下不能观察到3个实验组之间的膜融合有明显的差异。只有在pH值为6．0时，阳性对照组、无关单抗对照组及正常细胞组之间比较均有显着的差异(P＜0．05)(图1B)，说明在此条件下能够观察到阳性对照组、无关单抗组及正常细胞在膜融合实验中存在显着的膜融合差异，并最终进行分析计算。因此，在接下来的实验中均采用pH 6．0作为膜融合实验新方法的最佳pH条件。

图1 膜融合实验新方法的最pH值测定

图2 膜融合实验新方法的最佳时间点测定

2．2 膜融合实验新方法最佳观察时间点测定 在确定了膜融合实验新方法的最佳pH值以后，需要选定最为合适的时间点观察各个实验组的病毒—细胞膜融合，并拍摄活细胞状态图片，最后通过软件对活细胞数量进行计数并分析实验结果。如图2所示，在pH值降低介导膜融合开始后的20 min内，未见明显的病毒—细胞膜融合所致的合胞体形成;第30分钟开始，无关单抗组出现明显的膜融合，并随着时间延长膜融合程度逐渐加剧，活细胞数目逐渐减少;在100 min的时候，结果显示病毒—细胞膜融合已经达到最大且一直持续至随后的所有时间点。阳性对照4G2显示出了较强的膜融合抑制能力，而正常细胞组未见明显的膜融合。因此我们认为在pH值降低后100 min是观察并分析膜融合发生的最佳时间点，在此时间点上既能观察到充分的膜融合现象，正常细胞形态亦没有受到影响。

2．3 单抗9F12的膜融合抑制活性测定 我们通过新建立的膜融合实验体系对交叉中和抗体9F12的膜融合抑制活性进行测定，将4G2和一株无关单抗分别作为阳性对照、阴性对照。结果发现2株单抗确实如前期研究所示能够阻断病毒—细胞宿主膜融合，且呈现出剂量依赖模式(见图3A)，9F12和4G2 半数抑制浓度 IC50分别为 0．02、0．03 g·L－1。在高浓度作用下(1．0 g·L－1)，单抗9F12组的细胞融合率为12．9%，高于阳性对照4G2组的7．6%。(见图3B)。另外，无关单抗组及病毒对照组的细胞膜融合率均达到了90%以上，而正常细胞组未见到膜融合。

3 讨论

登革病毒(DENV)广泛流行于热带和亚热带的许多国家和地区，是亚洲和拉丁美洲一些国家儿童严重患病和死亡的主要原因之一［8]。DENV属于黄病毒科的黄病毒属，该种属还包含了其他重要的人病原体如日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)西尼罗(west nile，WN)黄热病(yellow fever，YF)及蜱传脑炎(tick borne encephalitis，TBE)等病毒［9]。作为一种小型包膜虫媒病毒，DENV通过受体介导的内吞作用以及随着病毒包膜与宿主细胞内涵体膜的融合进入细胞内复制［10]。不同包膜病毒激活融合蛋白构象变化的因素并不相同，主要分为三种［1]:(1)低pH环境(虫媒病毒、流感病毒);(2)与受体相互作用(副粘液病毒、逆转录病毒);(3)pH降低与受体作用同时存在(α逆转录病毒)。目前，世界上既无安全有效的登革病毒疫苗，亦无特异性的治疗药物［11－12]。大量的研究集中于抗病毒中和抗体的作用机制分析，中和抗体被证实能够通过抑制病毒与宿主细胞膜融合而中和病毒感染。本研究建立了一种有别于传统实验方法的膜融合实验新方法对抗体的膜融合抑制活性进行测定。此方法基于活细胞显微技术，借助Incell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统，既能实时观察细胞膜融合的发生、发展，又能通过软件对结果进行定量分析。经过对膜融合实验新方法进行优化后，我们最终确立了实验的最佳酸性环境及最佳数据读取时间，分别为pH值6．0及环境酸性化后的100 min。

图3 中和抗体9F12的膜融合抑制活性测定

我们将优化的膜融合实验新方法初步应用于2株中和抗体4G2、9F12，前期研究显示二者具备抑制膜融合的能力。我们的新方法进一步证实了4G2和9F12均具备抑制病毒包膜与宿主细胞内涵体膜融合的能力，且呈现剂量依赖模式，最终计算出精确的IC50。这一结果说明我们的基于活细胞显微技术的膜融合实验方法不仅能够非常清晰地观察DENV中和抗体是否具备膜融合抑制能力，还能计算出相应的半数抑制浓度，获得精确的定量结果。

总之，本研究建立了一种基于活细胞显微技术的膜融合抑制实验新方法，对实验方法进行优化后证实此方法可应用于登革病毒中和抗体的膜融合能力测定，有助于深入了解抗体的中和作用机制。同时，该体系同样适用于其他虫媒病毒，为登革病毒及其他虫媒病毒的相关研究奠定了基础。

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