靳立振，赵永华，于巧青
作者单位：廊坊市人民医院重症医学科，河北 廊坊065000
肺纤维化是一种肺间质性疾病，研究显示上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）是引发肺纤维化的主要原因，EMT 发生过程涉及转化因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）等多种细胞因子，TGFβ1 可通过诱导EMT 发生从而促进肺泡上皮细胞转化为成纤维细胞，同时可通过抑制蛋白水解酶生成而促使细胞外基质沉积从而引发肺纤维化。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在TGFβ1 干预后的肺泡上皮A549 细胞中表达异常，并可能参与肺纤维化形成过程。因而探寻新型miRNA 分子并探究其在肺纤维化形成过程中的作用机制具有重要意义。研究表明微小RNA-212（microRNA-212，miR-212）表达异常与炎症反应、免疫缺陷疾病及慢性肾病等相关疾病发生发展密切相关。miR-212 还可促进二氧化硅（SiO）诱导的EMT 过程。但miR-212 在肺纤维化发生过程中的作用机制尚未可知。Targetscan 预测显示TOB2 可能是miR-212 的靶基因，TOB2 过表达可抑制肺上皮细胞EMT 过程及迁移能力。但miR-212是否可通过调控TOB2 表达从而参与肺纤维化过程尚未可知。本研究自2018 年3 月至2019 年3 月在TGFβ1 干预A549 细胞中检测miR-212、TOB2 的表达变化，初步分析其在肺纤维化发生过程中的可能作用，为进一步探讨肺纤维化形成机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肺泡上皮A549 细胞（美国ATCC 公司）。TGFβ1（美国PeproTech 公司）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（均为美国Hyclone 公司）；Lipofectamine2000（美国Thermo Fisher公司）；miR-212 抑制剂（anti-miR-212）及其阴性对照（anti-miR-con）、miR-212 模拟物（mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miR-con）、TOB2 小干扰RNA（si-TOB2）及无意义序列（si-con）（均为上海吉玛制药技术有限公司）；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海泽叶生物科技有限公司）；双荧光素酶报告基因载体（美国Promega 公司）及活性检测试剂盒（美国Promega 公司）；细胞周期蛋白1（CyclinD1）（美国Santa Cruz 公司）、TOB2 单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋a1（COL1a1）、上皮钙黏附素（E-cadherin）（均为美国Epitomics 公司）；Trizol、反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒（均为大连宝生物工程有限公司）。1.2 方法
1.2.1 细胞来源及培养条件 人肺泡上皮A549 细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，培养条件：37 ℃、体积分数5%二氧化碳培养箱，待细胞生长融合度达到70%时用不含血清的培养基饥饿处理24 h。
1.2.2 实验分组 采用随机数字表法分成6组：PBS组（用普通培养液培养48 h）、TGFβ1 组（含有5 ng/mLTGFβ1 培养液培养48 h）、TGFβ1+anti-miR-con组（转染anti-miR-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培养液培养48 h）、TGFβ1+anti-miR-212 组（转染antimiR-212 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培养液培养48 h）、TGFβ1+ anti-miR-212+si-con 组（共 转 染antimiR-212 与si-con 后使用含有5 ng/mLTGFβ1 培养液培养48 h）、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2 组（共转染anti-miR-212与si-TOB2后使用含有5 ng/mLTGFβ 1培养液培养48 h）。
1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-212、TOB2 mRNA 表达水平 采用Trizol 法提取各组细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计测定RNA 浓度，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见表1。配置qRT-PCR 反应体系，严格按照试剂盒说明书进行操作，反应条件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，循环40 次，miR-212 以U6 为内参，TOB2以β-actin 为内参，采用2法计算miR-212、TOB2 mRNA相对表达量。
1.2.4 MTT 检测细胞增殖 收集对数生长期A549细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为5×10个/毫升，接种于96 孔板（100 微升/孔），置于温度37 ℃、相对湿度95%、体积分数5%二氧化碳培养箱内培养，弃按照“1.2.1”处理，每孔加入20 μL MTT 溶液，继续培养4 h，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡混匀，利用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度（OD）值，细胞增殖率（%）= 实验组/空白组×100%。
1.2.5 荧光素酶报告基因检测 将荧光素酶报告载体WT- TOB2、MUT- TOB2 分别与miR-212 mimics、miR-NC 共转染A549 细胞，转染24 h 后收集细胞，根据荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测细胞相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值）。
1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测CyclinD1、Vimentin、α-SMA、COL1a1、E-cadherin 蛋 白 表 达收集各组细胞，加入蛋白裂解液，4 ℃条件下12 000 r/min 转速离心10 min（离心半径6 cm）提取细胞总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，蛋白上样量30微克/孔，转膜，BSA 封闭1 h，加入蛋白一抗，TBST洗涤，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL 显色，曝光，显影，采用Quantity One 软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。
表1 引物序列
1.3 统计学方法
应用SPSS 21.0 统计学软件分析数据。结果均为正态计量资料，以x ± s 表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P ＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 TGF-
β1 对A549 细胞中的miR
-212 和TOB2表达的影响
实验结果显示，相较于PBS组，TGFβ1组A549 细胞中miR-212 的表达水平显着升高（P ＜0.05），而TOB2 mRNA 及蛋白表达水平显着降低（P ＜0.05），见表2。
表2 TGFβ1对A549细胞中miR-212和TOB2的表达（n=9）/x ± s
2.2 干扰miR-212 抑制TGF
β1 诱导A549 细胞增殖的影响
与PBS组相比，TGFβ1组A549细胞增殖率显着升高（P ＜0.05），细胞增殖相关蛋白CyclinD1的表达水平显着升高（P ＜0.05）；相较于TGFβ1+antimiR-con 组，TGFβ1+anti-miR-212 组A549 细胞增殖率显着降低（P ＜0.05），细胞增殖相关蛋白CyclinD1蛋白表达水平显着降低（P ＜0.05），见表3。
表3 干扰miR-212抑制TGFβ1诱导A549细胞增殖和CyclinD1的表达（n=9）/x ± s
2.3 干 扰miR-212 抑 制TGF
β1 诱 导A549 细 胞EMT 和COL1a1 蛋白表达
与PBS 组相比，TGFβ1组A549 细胞中EMT 间质细胞标志物Vimentin、α-SMA、及纤维化标记蛋白COL1a1 的表达水平均显着升高（P ＜0.05），EMT 上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平显着降低（P ＜0.05）；与TGFβ1+antimiR-con 组相比，TGFβ1+anti-miR-212 组A549 细胞中EMT 间质细胞标志物Vimentin、α-SMA 及纤维化标记蛋白COL1a1 的表达水平均显着降低（P ＜0.05），EMT 上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白表达水平显着升高（P ＜0.05），见图1、表4。
图1 检测A549细胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表达
2.4 miR-212 靶 向 调 控TOB2 表 达
Targetscan预测到miR-212 靶向TOB2。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染WT-TOB2 的miR-212 组荧光素酶活性显着低于miR-con 组（P ＜0.05），共转染MUT-TOB2 的miR-212 组与miR-con 组荧光素酶活性比较差异无统计学意义，见表5。Western blot 检测结果显示，与miR-con 组相比，miR-212 组A549 细胞中TOB2 蛋白表达水平显着降低（P ＜0.05）；与anti-miR-con 组相比，antimiR-212 组A549 细胞中TOB2 蛋白表达水平显着升高（P ＜0.05），见图2、表6。
图2 蛋白免疫印迹检测结果
2.5 下 调TOB2 和 干 扰miR
-212 对TGF
β1 诱 导A549细胞增殖、EMT和纤维化的影响
相较于TGFβ 1+ anti-miR-212+si-con 组，TGFβ1+ anti-miR-212+si-TOB2组A549细胞增殖率显着升高（P ＜0.05），细胞增殖相关蛋白CyclinD1与EMT间质细胞标志物Vimentin、α-SMA及纤维化标记蛋白COL1a1的表达水平显着升高（P ＜0.05），EMT上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平显着降低（P ＜0.05），见图3，表7。3 讨论
肺纤维化发病机制尚未完全阐明，但研究报道指出遗传因素与氧化应激等可能引发肺纤维化，其主要病理特点为肺泡上皮细胞损伤与修复处于失衡状态导致肺功能逐渐丧失，随着疾病恶性进展可造成患者因呼吸衰竭而死亡。肺泡上皮细胞恶性增殖、肺泡炎及成纤维细胞增殖等均可参与肺纤维化形成过程。已有报道指出miRNA 在肺纤维化形成过程中发挥重要调控作用。因此本研究寻找miRNA 并分析其在肺纤维化发生中的分子机制，为肺纤维化的防治提供新方向。
表4 干扰miR-212抑制TGFβ1诱导A549细胞EMT和COL1a1蛋白表达（n=9）/x ± s
表5 双荧光素酶报告实验（n=9）/x ± s
表6 miR-212靶向TOB2调控其表达（n=9）/x ± s
图3 检测A549细胞中CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA和COL1a1蛋白表达
miR-212 与miR-132 结构相同并具有相似生物学功能，研究表明miR-212 在多种炎症性疾病中呈高表达，并可能参与肿瘤、神经等相关性疾病发生发展过程。但miR-212 在肺纤维化中的表达变化尚未可知。本研究通过TGF-β1 诱导肺泡上皮A549 细胞拟构建肺纤维化模型，结果显示TGF-β1处理后A549 细胞中miR-212 的表达水平显着升高，提示miR-212 表达量增加可能促进肺纤维化发生。本研究进一步研究发现干扰miR-212表达可显着降低TGF-β1 诱导的A549 细胞增殖率，并可抑制CyclinD1 表达，说明干扰miR-212 表达可抑制TGFβ1诱导A549 细胞增殖。研究报道指出CyclinD1 可正向调控细胞周期，促进细胞增殖。提示干扰miR-212 表达可能通过抑制CyclinD1 表达而抑制A549细胞增殖从而抑制肺纤维化发展进程。研究表明TOB2 属于抗细胞增殖基因，脑损伤发生时TOB2 表达水平降低导致机体炎症细胞分泌量增加从而加重脑组织损伤程度，若增加TOB2 表达量可减少炎症细胞增殖分化从而减轻脑组织内炎症反应。本研究结果显示TGF-β1处理后可显着降低A549细胞中TOB2 的表达，说明TOB2 表达量降低可能引发肺部炎症反应导致肺纤维化发生。本研究试图分析miR-212与TOB2的相关性，通过双荧光素酶报告实验证实miR-212可靶向调控TOB2的表达，进一步研究显示下调TOB2 表达可逆转干扰miR-212 对TGFβ1 诱导A549 细胞增殖的抑制作用，提示干扰miR-212 表达可通过上调TOB2 的表达抑制TGFβ1诱导的A549细胞增殖。
表7 下调TOB2和干扰miR-212对TGFβ1诱导A549细胞增殖、EMT和纤维化的影响（n=9）/x ± s
肺纤维化发生早期可促进前炎性介质、趋化因子表达，TGFβ1 可通过促进EMT 转化从而促进肺纤维化恶性进展。EMT 表现为上皮细胞向间质细胞进行转化，其中上皮细胞标志物E-cadherin 表达降低，间质标志物Vimentin表达升高，α-SMA作为间叶标记物可用于评价EMT 转化。COL1a1 表达量升高可作为成纤维细胞增多或纤维化的有效标志物。本研究结果显示TGFβ1 诱导A549 细胞中Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表达量显着增加，Ecadherin 蛋白表达量显着降低，说明TGFβ1 可促进A549 细胞EMT 转化进程。同时本研究发现干扰miR-212 表 达 后 可 显 着 降 低Vimentin、α-SMA、COL1a1 蛋白表达，而促进E-cadherin 蛋白表达，但下调TOB2 的表达可部分逆转干扰miR-212 表达对TGFβ1 诱导A549 细胞EMT 及纤维化。提示干扰miR-212 表达可通过上调TOB2 的表达从而抑制TGFβ1诱导A549细胞EMT及纤维化。
综上所述，miR-212 在TGFβ1 干预A549 细胞中呈高表达，TOB2 表达水平降低，干扰miR-212 表达可通过促进TOB2 的表达而抑制TGFβ1 诱导的A549 细胞纤维化及EMT 转化进程，可为肺纤维化的防治提供潜在靶点。但关于其具体作用机制仍需进一步研究。
