刘宏伟，王玉华
作者单位：1沧州市传染病医院肝病科，河北 沧州061001；2沧州市人民医院检验科，河北 沧州061001
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝性双链DNA 病毒，其生物活性及复制水平受各种因素影响，HBV 感染可导致急性或慢性肝炎，是引起肝纤维化、肝硬化、肝癌的独立危险因素。研究发现HBV 基因组X 区编码的乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）及其羧基端截断体在HBV 相关性肝炎发展为肝细胞癌过程中发挥重要作用。微小RNA-155（MicroRNA-155，Mir-155）是一个多功能miRNA，可介导炎症反应，呈递抗原，调控免疫过程中细胞因子生成等，与变应性鼻炎、慢性乙型肝炎（CHB）等多种炎症性疾病及肝癌有关。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）属于NOD 样受体分子，作为固有免疫重要组分在机体免疫及疾病发生发展中发挥重要作用，主要由HBx蛋白与线粒体外孔蛋白结合后活性氧水平增加激活，与糖尿病合并慢性牙周炎、系统性红斑狼疮、肝癌等疾病有关。然而关于Mir-155 联合NLRP3与CHB 的关系尚鲜有报道，因此本研究拟通过检测CHB 病人外周静脉血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）Mir-155、NLRP3 水平，拟探究其与HBV-DNA 载量的关系及其可能机制，以期为CHB病人靶向治疗提高一定理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017 年6 月至2019 年9 月沧州市传染病医院收治经肝脏病理活检证实CHB 病人118 例为CHB 组，男性65 例，女性53 例，年龄（58.29±13.21）岁，年龄范围为22～70 岁，其中HBVDNA ＜1×10拷贝/毫升（低载量组）51 例，1×10拷贝/毫升HBV-DNA ≤1×10拷贝/毫升（中载量组）38例，HBV-DNA ＞1×10拷贝/毫升（高载量组）29例，e抗原阳性病人57 例，e 抗原阴性病人61 例；穿刺肝组织病理诊断按照慢性肝炎炎症分级分为G2 级51例，G3 级32 例，G4 级35 例；按照肝纤维化分期分为S2 期56 例，S3 期39 例，S4 期23 例。另选取同期门诊健康体检者118 例为健康对照组，男性61 例，女性57 例，年龄（56.14±12.36）岁，年龄范围为22～73岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经过沧州市传染病医院道德伦理委员会批准通过，批准文号1710021，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。收集所有受试者临床检查资料，所有样品采集及资料调查均取得病人及其近亲属知情同意并签字确认。1.2 纳入及排除标准
纳入标准：（1）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015版）》关于CHB诊断标准；（2）均为HBV 感染型肝炎病人；（3）血液样品采集前未接受任何保肝降酶等药物治疗；（4）均自愿配合本次调查研究者。排除标准：（1）合并非酒精性脂肪肝、其他类型肝炎病毒感染、肝癌或其他恶性肿瘤者；（2）妊娠或哺乳期妇女；（3）合并心、肺、肾等脏器功能障碍者；（4）合并自身免疫性疾病者；（5）临床资料不完整者。
1.3 方法
1.3.1 试剂及主要仪器 RNA 提取试剂盒（编号R0011）购自上海碧云天有限公司；淋巴细胞分离液（货号abs930）购自上海爱必信生物科技有限公司；PrimeScript™Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（货号6210A）、microRNA 定量（qRT-PCR）试剂盒（编号638314）、TB Green® Premix Ex Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（编号RR820A）均购自大连宝生物科技有限公司；引物由上海吉玛生物科技有限公司合成；蛋白抽提试剂盒（批号P0028）、BCA 蛋白定量试剂盒（批号P0010S），购自上海碧云天有限公司；人IL-1β试剂盒（货号BMS213HS）、人IL-18 ELISA 试剂盒（货号KMC0181）、兔源一抗NLRP3 抗体（货号PA5-20838）、GAPDH 抗体（货号TAB1001），二抗羊抗兔IgG（货号A32731）购自美国Invitrogen。MODEL550型酶标仪、7300 RT-qPCR仪（美国Bio-Rad公司）等。
1.3.2 标本采集 收集所有受试者清晨空腹外周静脉血6 mL，分两份保存，每份3 mL，其中一份添加淋巴细胞分离液提取PBMC，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。另一份于室温下3 000 r/min（有效离心半径5 cm）离心15 min分离血清。两份采集标本立即送检或置于-80 ℃冰箱保存待检。
1.3.3 血清HBV-DNA 载量检测 采用实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测血清HBV-DNA载量。
1.3.4 PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平 采用RNA 提取试剂盒提取PBMC 总RNA，反转录得cDNA 置于-20 ℃保存备用。采用RT-qPCR 法对Mir-155、NLRP3 mRNA 进行扩增。反应体系共25 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）/TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上反向引物（10 μmol/L）各1 μL，双蒸水8.5 μL。反应条件：95 ℃，5 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 个循环；添加溶解曲线。Mir-155 正向引物序列（5′→3′）为：TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT，反向引物序列（5′→3′）为：CCT TAA AAC TCC ACT AGA AGC A；NLRP3 mRNA 正向引物序列（5′→3′）为：CGT GAG TCC CAT TAA GAT GGA GT，反向引物序列（5′→3′）为：CCC GAC AGT GGA TAT AGA ACA GA-3；内参U6 正向引物序列（5′→3′）为：GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T，反向引物序列（5′→3′）为：CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT；GAPDH 正向引物序列（5′→3′）为：GTC GAT GGC TAG TCG TAG CAT CGA T；反向引物序列（5′→3′）为：TGC TAG CTG GCA TGC CCG ATC GAT C。 PBMC Mir-155、NLRP3 mRNA相对表达水平采用2法进行分析。
1.3.5
PBMC 中NLRP3 蛋白表达水平 采用免疫印迹（Western blot，WB）检测PBMC 中NLRP3 蛋白表达。采用蛋白抽提试剂盒提取PBMC 总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。取适量蛋白样品于80 mV 电压下6%SDS-PAGE 电泳2 h，250 mA 下PVDF 膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入适量含2%脱脂奶粉的PBS 稀释，加NLRP3（1∶200）及健康对照GAPDH 抗体（0.5 μg/mL）4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜3 次，每次20 min，用适量含2%脱脂奶粉的PBS 稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（1∶5 000）室温孵育1.5 h，按上述方法洗膜，显色，曝片，观察并分析结果。1.3.6
血清IL-1β、IL-18 水平检测 采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELLSA）检测血清白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）水平，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。正态分布计量资料以x ± s表示，两组间比较用t 检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA 检验），进一步两两比较采用SNK-q 检验；计数资料用例（%）表示，两两比较采用χ检验。采用Pearson 法分析PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA及其血清IL-1β、IL-18水平的相关性。P ＜0.05为差异有统计学意义。
表1 CHB病人与健康对照组一般资料比较
2 结果
2.1 两组一般资料比较
两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P ＞0.05），与健康对照组比较，CHB组血清肝功能指标天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平均显着升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。2.2 不同HBV-DNA载量CHB病人PBMC 中Mir
-155、NLRP3 水平比较
与HBV-DNA 低载量组比较，中、高载量组CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 及蛋白水平依次增加，均差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2，图1。
图1 不同HBV-DNA载量CHB病人PBMC中NLRP3蛋白表达
表2 不同HBV-DNA载量CHB病人外周静脉血单个核细胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平比较/x ± s
2.3 不同HBV-DNA 载量CHB 病人血清IL
-1
β、IL
-18 水平比较
与HBV-DNA 低载量组比较，中、高载量组CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平依次增加，与HBV-DNA 中载量组比较，高载量组CHB 病人血清IL-1β、IL-18 水平均增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。
表3 不同HBV-DNA载量CHB病人血清IL-1β、IL-18水平比较/（ng/L，x ± s）
2.4 PBMC 中Mir
-155、NLRP3 mRNA 水 平 与CHB 病人肝炎炎症分级及肝纤维化分期的关系
随肝炎炎症分级增加、肝纤维化分期增加，PBMC 中Mir-155、NLRP3 mRNA 水平依次增加，差异有统计学意义（均P ＜0.05），见表4。
2.5 CHB 病人PBMC 中Mir
-155、NLRP3 蛋白水平的相关性分析
Pearson 相关性分析结果显示，CHB 病人PBMC 中Mir-155、NLRP3 水平呈显着正相关（r=0.714，P ＜0.05）。见图2。
图2 CHB病人外周静脉血单个核细胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平的相关性
2.6 CHB病人PBMC中Mir-155、NLRP3水平与血清IL-1
β、IL-18水平相关性分析
Pearson相关性分析结果显示，CHB 病人PBMC 中Mir-155 与血清IL-1β、IL-18水平均呈正相关（P ＜0.05），NLRP3水平与血清IL-1β、IL-18水平呈显着正相关（P ＜0.05）。见表5。
表5 CHB病人外周静脉血单个核细胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3水平与血清IL-1β、IL-18水平相关性
3 讨论
CHB 是一种重大肝脏传染性疾病，全球约20多亿HBV 携带者，3.6 亿CHB 病人，且每年约有60 万人因HBV 相关性肝衰竭、肝硬化或肝细胞癌死亡，严重危害人类健康。目前临床治疗CHB 多以干扰素、核酸类等药物为主，以靶向病毒逆转录酶结构域破坏HBV-DNA 合成，但HBV-DNA 感染机及发病制尚不完全清楚，因此寻找HBV-DNA 复制相关的生物分子进行CHB 靶向治疗具有重要意义。miRNA，是一类长链非编码小RNA，与先天性和获得性免疫密切相关，其中Mir-155 在免疫反应及炎症反应中发挥重要作用。Abdul-Maksoud 等研究发现，Mir-155 与类风湿性关节炎（RA）疾病活动度及炎症程度有关，血清Mir-155表达水平在RA 病人中显着高于健康对照组，且与肿瘤坏死因-α（TNF-α）、IL-1β 水平均呈正相关。Fang 等研究报道，与健康对照组比较，HBV 携带者及CHB 病人CD4+、CD8+T 细胞中Mir-155 水平依次升高，CHB病人PBMC 中Mir-155水平升高与T细胞活化有关，是HBV 感染免疫激活疾病进展的潜在标志物。吴晓升等研究报道，与健康对照组比较，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平显着 下 调，与ALT 正 常 的CHB 病 人 比 较，ALT 升 高 的CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水平显着升高，且于HBV-DNA 无相关性。本研究结果发现，与健康对照组比较，CHB 病 人PBMC 中Mir-155 水 平 显 着 升 高，随HBV-DNA 载量增加，CHB 病人PBMC 中Mir-155 水平依次升高，且与血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相关，而IL-1β、IL-18均为IL-1家族中重要促炎因子，与Fang 等结果一致，提示Mir-155 水平升高可能与CHB 病人HBV-DNA 复制有关，参与CHB 炎症反应。但与吴晓升等研究结果不一致，可能，因样本量选择差异，有待进一步验证。
表4 外周静脉血单个核细胞（PBMC）中Mir-155、NLRP3 mRNA水平与CHB病人肝炎炎症分级及肝纤维化分期的关系/x ± s
炎性小体由多种分子共同构成的高分子质量、多蛋白复合体，在固有免疫中其重要作用，目前已发现NLRP1、NLRP3、黑色素瘤缺失基因2 及ICE 蛋白酶激活因子4 中炎性小体，其中NLRP3 目前研究最多，结构和功能最为明确。研究报道，HBV 表达的HBx蛋白可上调NLRP3炎性小体表达，NLRP3激活后可刺激半胱天冬氨酸氨基酶-1 前提剪切活化为具有酶活性的Caspase-1，进而促进IL-1β、IL-18等促炎因子成熟并释放至胞外参与机体免疫、炎症反应。何子凡等研究报道，NLRP3 炎症小体参与慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）病人炎症反应，与健康对照组比较，稳定期、急性加重期慢阻肺病人PBMC 中NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18 水平依次增高。张任飞等研究报道，与正常组、单纯2 型糖尿病（T2DM）组、单纯慢性牙周炎（CP）组比较，T2DM合并CP 组 病 人 血 清NLRP3、Caspase-1 mRNA 及IL-1β 水平显着升高，且呈正相关，提示NLRP3 及IL-1β 可促进T2DM 合并CP 病人炎症反应，与疾病严重程度有关。本研究结果发现，CHB 病人PMBC中NLRP3 mRNA 及蛋白水平随HBV-DNA 载量增加而升高，均高于健康对照组，且与Mir-155 及血清IL-1β、IL-18 水平均呈正相关，与何子凡等、张任飞等研究结果一致。而陈洪涛等研究报道，与健康对照组比较，CHB 病人PBMC 中NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 水平差异无统计学意义，干扰素诱导蛋白16(IFI16)炎症小体水平显着升高，且于HBV-DNA 载量呈正相关，与本研究结果不一致，可能因样本量选择不同或CHB 病人HBV-DNA 感染过程中存在其他炎性小体共同参与。另本研究发现Mir-155、NLRP3 mRNA 水平与肝炎症分级及肝纤维分期有关，综合以上研究结果及本研究结果提示，Mir-155 可 能 协 同NLRP3 与CHB 病 人HBVDNA 复制有关，促进CHB 病人炎症反应，有待进一步深入探究。
