宋德顺，程华
作者单位：青岛市第八人民医院内镜诊疗科，山东 青岛 266100
结肠癌发病率、死亡率分别在全球癌症排名中位列第三和第四位［1］。由于生活方式、饮食习惯、生活条件的改变，结肠癌发病率、死亡率呈逐年上升趋势。早期结肠癌缺乏特征性症状，不易发现，且手术治疗效果不佳和化疗耐药，复发转移率较高，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题［2］。因此，探讨结肠癌发生发展的分子机制、寻找新的治疗策略迫在眉睫，对提高结肠癌的诊断、治疗和预后意义重大。环状RNA（circRNA，circular RNA）由单个具有基因调控潜能的mRNA 前体反向剪接而成。越来越多的证据表明，circRNA 与人类疾病尤其是癌症关系密切，由于其性质稳定，circRNA 具有潜在生物标志物作用［3-4］。研究显示，circRNA 肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MYLK）在前列腺癌中显着上调并促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示肌球蛋白轻链激酶（circMYLK）可能是一种致癌基因［5］。序列分析发现，微小RNA-497-5p（miR-497-5p）与circMYLK 存在理论互补结合位点。miR-497-5p 已被证实在结肠癌中表达下调，上调miR-497-5p 表达抑制结肠癌进展［6］。然而，circ‑MYLK能否靶向miR-497-5p参与结肠癌进展尚未可知。因此，于2019 年3 月至2020 年1 月本研究旨在通过体外细胞实验揭示circMYLK 在结肠癌中的作用和可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料结肠癌细胞SW480、SW620、Caco-2以及正常结肠上皮细胞NCM460购于中国典型培养物保藏中心；RPMI-1640 培养基、DMEM 培养基购于美国Gibco 公司；胎牛血清、青链霉素双抗溶液购于北京索莱宝生物科技公司；Taqman miRNA 逆转录试剂盒、TRIzol 试剂购于美国Invitrogen 公司；Prime‑Script RT reagent Kit、SYBR Green Master Mix 购于大连TaKaRa 生物公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）、放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白分析试剂盒、购于南京凯基生物公司；Transwell小室和基质胶购于美国BD 公司；兔源细胞周期蛋白D1（cyclinD1）单克隆抗体、兔源P21 单克隆抗体、兔源基质金属蛋白酶2（MMP-2）单克隆抗体、兔源MMP-9 单克隆抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶（GAP‑DH）单克隆抗体、山羊抗兔IgG 购于上海艾博抗公司。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 SW480、SW620、Caco-2 细胞均采用RPMI-1640 培养基进行培养，NCM460 细胞采用DMEM 培养基进行培养所有培养基中均补充10%的胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 µg/mL 的链霉素。当细胞生长至汇合度80%时，按照1∶4 比例进行消化传代。
1.2.2实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测circ‑MYLK 和miR-497-5p 表达 采用TRIzol 试剂分别提 取NCM460、SW480、SW620、Caco-2 细 胞 中 总RNA。用Taqman miRNA 逆转录试剂盒将miRNA转化为cDNA。用3 U/mg RNase R 于37 ℃条件下孵育总RNA 15 min，利用PrimeScript RT reagent Kit 将mRNA 转化为cDNA。以cDNA 为扩增模板，利用SYBR Green Master Mix 进行RT-qPCR 扩增。以GAPDH、U6为内参照基因，2-ΔΔCt法分析circMYLK和miR-497-5p 的相对表达水平。circMYLK 正向引物序列5’-CAATCTTCTTATGCGGCGG-3’，反向引物序 列5’-GTACCGGCGCAGTCAGG-3’；miR-497-5p正向引物序列5’-AGCGAAGTTTTGAGCCGATC‑GGGC-3’，反向引物序列5’-GCCGTGAGTCAGAG‑GTGGT-3’；GAPDH 正 向 引 物 序 列5’-ATCCAC‑GGGAGAGCGACAT-3’，反向引物序列5’-CAGCT‑GCTTGTAAAGTGGAC-3’；U6 正 向 引 物 序 列5’-ACAGATCTGTCGGTGTGGCAC-3’，反向引物序列5’-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3’。
1.2.3细胞转染、细胞分组 按照2×105个/孔的密度将对数期SW480 细胞接种6 孔板，当细胞50%汇合时更换不含血清培养基进行细胞转染。首先，取50 pmol 的待转染物阴性对照（si-NC）、干扰circ‑MYLK（si-circMYLK）、过表达对照（miR-NC）、miR-497-5p 模 拟 物（miR-497-5p mimics）、干 扰circ‑MYLK+抑制物对照（si-circMYLK+anti-miR-NC）、干扰circMYLK+ miR-497-5p 抑制物（si-circMYLK+an‑ti-miR-497-5p）与适量无血清培养基混合，使其总体积 为25 µL，记 为 混 合 物A。取1 µL 的Lipo‑fectamine 3000 与24µL 无血清培养基混合，记为混合物B。室温静置5 min 后，将混合物A 和缓和物B混合均匀，记为混合物C。将混合物C 加入到细胞汇合度为50%的培养基中，6 h 后更换为含血清培养基，转染48 h 时收集细胞，RT-qPCR 测定转染效果，合格后进行后续实验。
1.2.4CCK-8法检测细胞活力 按照5×103个/孔的密度将各转染组细胞接种96 孔板，在培养24 h、48 h、72 h 时各取出一板细胞，按照10µL/孔加入CCK-8 试剂，暗室孵育1 h 后，采用酶标仪测定细胞在450 nm 处的光密度（optical density，OD）值以反映细胞的增殖活性。
1.2.5Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力迁移实验时取200 µL 无血清培养液稀释的各组细胞悬液（2×105个/毫升）加入到Transwell 上腔室，取600µL 含10%胎牛血清的培养液加入到24 孔下室作为趋化剂。37 ℃孵育24 h 后，用棉签擦去上室未迁移细胞，用1%多聚甲醛固定至下室膜，0.5%结晶紫染色，然后在光学显微镜下随机选择五个视野计数和拍照，以其均数表示细胞迁移细胞数。侵袭实验时采用涂有基质胶的Transwell 小室，其余步骤同迁移实验。
1.2.6蛋白质印迹法（Western blotting）检测Cy‑clinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平 采用放射免疫沉淀试验缓冲液提取总蛋白，BCA 蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到PVDF 膜上。用5%牛血清白蛋白室温封闭膜1 h后，将膜至于稀释的一抗溶液中4 ℃孵育过夜，再用稀释的二抗室温孵育膜1 h。用电化学发光显色试剂盒进行显影、曝光。以GAPDH 为内参，用Bio-Rad Quantity One 软件分析对单个蛋白条带进行灰度分析。
1.2.7双荧光素酶报告基因实验 Starbase 数据库在线分析显示circMYLK 与miR-497-5p 存在连续互补结合位点。将含有miR-497-5p 预测结合位点或预测结合位点突变序列的circMYLK 克隆到pGL3-REPORT 双荧光素酶载体中，获得荧光素酶报告基因载体WT-circMYLK 和MUT-circMYLK。以Lipo‑fectamine 3000 作为转染试剂，将WT-circMYLK 和MUT-circMYLK 分别与miR-497-5p mimics 或miRNC 转染到SW480 细胞中。培养48 h 后收集细胞，使用双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶活性。为确定circMYLK 对miR-497-5p 表达的调控作用，将pcDNA、pcDNA-circMYLK、si-NC、si-circMYLK 分别转染SW480 细胞，转染48 h 时，检测各组细胞miR-497-5p的相对表达水平。
1.3 统计学方法采用SPSS 19.0 进行统计分析。每组设置3 个平行实验，重复3 次。计量资料满足正态性和方差齐性用±s形式表示。采用t检验比较两组间差异；采用单因素方差分析比较多组间差异，进一步多重比较采用SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 circMYLK 和miR-497-5p 在结肠癌细胞中的表达结肠癌细胞SW480、SW620、Caco-2 中circ‑MYLK 表达较正常结肠上皮细胞NCM460 显着升高（P<0.05），miR-497-5p 表达较NCM460 细胞显着降低（P<0.05）。见表1。选择SW480 细胞进行后续研究。
表1 circMYLK和miR-497-5p在结直肠癌细胞中的表达/±s
表1 circMYLK和miR-497-5p在结直肠癌细胞中的表达/±s
注：circMYLK 为肌球蛋白轻链激酶，miR-497-5p 为微小RNA-497-5p。①与NCM460细胞比较，P<0.05。
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2.2 干扰circMYLK 表达对SW480 细胞增殖、迁移和侵袭的影响si-circMYLK 组SW480 细胞circ‑MYLK 的表达水平较si-NC 组显着降低（t=18.44，P<0.05），表明转染si-circMYLK 后SW480 细胞中circ‑MYLK 表达受到抑制。干扰circMYLK 表达后SW480 细胞OD450值、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋 白 表 达 显 着 降 低（t=18.97，13.76，15.02，17.73，21.73，31.62，P<0.05），P21 蛋白表达显着升高（t=24.15，P<0.05）。见表2。
表2 干扰circMYLK表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响/±s
表2 干扰circMYLK表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响/±s
注：circMYLK 为肌球蛋白轻链激酶，CyclinD1 为细胞周期蛋白D1，P21 为周期素依赖激酶抑制剂，MMP-2 为基质金属蛋白酶-2，MMP-9 为基质金属蛋白酶-9。
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2.3 miR-497-5p 过表达对SW480 细胞增殖、迁移和侵袭的影响miR-497-5p 组SW480 细胞中miR-497-5p表达水平较miR-NC组显着升高（P<0.05），说明转染miR-497-5p mimics 后SW480 细胞中miR-497-5p 表达得到上调。过表达miR-497-5p 后SW480 细胞OD450值、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达显着降低（t=17.54，8.78，13.17，18.34，17.49，18.60，P<0.05），P21 蛋白表达显着升高（t=22.14，P<0.05）。见图1，表3。
表3 miR-497-5p过表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响/±s
表3 miR-497-5p过表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响/±s
注：miR-497-5p为微小RNA-497-5p，CyclinD1为细胞周期蛋白D1，P21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1，MMP-2为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。
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图1 miR-497-5p过表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响
2.4 circMYLK 靶向调控miR-497-5p 的表达StarBase 数据库在线分析显示，circMYLK 与miR-497-5p 存在理论互补结合位点，见图2。双荧光素酶报告实验显示，miR-497-5p mimics 和WT-circ‑MYLK共转染组SW480细胞的相对荧光素酶活性较miR-NC 和WT-circMYLK 共转染组显着降低（t=26.71，P<0.05）；而miR-497-5p mimics 和MUT-circ‑MYLK共转染组SW480细胞的相对荧光素酶活性与miR-NC 和MUT-circMYLK 共转染组比较无变化（t=0.98，P>0.05），见表4。pcDNA-circMYLK 组SW480 细 胞miR-497-5p表达0.54±0.05 较pcDNA 组1.00±0.05 显着降低（t=19.52，P<0.05）；si-circMYLK 组SW480 细 胞miR-497-5p 表达3.07±0.22 较si-NC 组0.98±0.09 显着升高（t=26.38，P<0.05）；四组总体SW480 细胞miR-497-5p表达比较F=754.12，P<0.001。
表4 双荧光素酶报告实验/±s
表4 双荧光素酶报告实验/±s
注：miR-NC为过表达对照，miR-497-5p为微小RNA-497-5p。
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图2 circMYLK的序列中含有与miR-497-5p互补的核苷酸序列
2.5 抑制miR-497-5p 表达逆转了干扰circMYLK表达对SW480 细胞增殖、迁移和侵袭的作用sicircMYLK+anti-miR-497-5p 组SW480 细 胞miR-497-5p 的表达较si-circMYLK+ anti-miR-NC 组显着降低（t=9.99，P<0.05），细胞OD450值、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋 白 表 达 较si-circ‑MYLK+anti-miR-NC 组 显 着 升 高（t=15.38，16.02，14.32，18.01，20.80，23.30，P<0.05），P21 蛋白表达较si-circMYLK+anti-miR-NC 组显着降低（t=9.01，P<0.05）。见图3，表5。
表5 抑制miR-497-5p表达逆转了干扰circMYLK表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的作用/±s
表5 抑制miR-497-5p表达逆转了干扰circMYLK表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭的作用/±s
注：si-circMYLK+anti-miR-NC 为干扰circMYLK+抑制物对照，si-circMYLK+anti-miR-497-5p 为干扰circMYLK+抑制物miR-497-5p。Cy‑clinD1为细胞周期蛋白D1，P21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1，MMP-2为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。
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图3 抑制miR-497-5p表达逆转了干扰circMYLK表达对SW480细胞增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达的作用
3 讨论
circRNA 是一种内源性RNA，主要在真核转录组中表达，参与调控基因表达，在肿瘤发生发展中发挥重要作用［7］。本研究通过探讨circMYLK 在结肠癌中调节机制，以期为未来肿瘤的预防和治疗提供新思路。
circMYLK 是调节肌球蛋白功能的重要分子，对细胞骨架、细胞增殖和肌肉收缩均有影响。近年研究发现，circMYLK 在多种肿瘤进展中发挥致癌因子作用。例如，circMYLK 在肾细胞癌中表达上调，cir‑cMYLK 高表达与肿瘤体积增加、远端转移和较差的预后相关，沉默circMYLK能够抑制肿瘤的生长和转移［8］。circMYLK 在喉鳞癌中亦呈表达增加，circ‑MYLK 高表达促进喉鳞癌细胞增殖和G1/S 细胞周期过渡，而敲除circMYLK 则有相反的效果［9］。此外，敲除circMYLK对肝细胞进展也具有显着的抑制作用［10］。与前任研究类似，本研究发现结肠癌细胞中circMYLK 表达较正常结肠上皮细胞NCM460 显着升高，提示circMYLK高表达可能与结肠癌细胞的异常生物学行为有关。采用结肠癌细胞SW480 进行功能分析发现，转染si-circMYLK 干扰circMYLK可显着降低SW480 细胞活力、迁移和侵袭能力。P21 是细胞增殖的负性调控因子，其通过抑制细胞周期依赖性激酶活性具有阻止G1/S 期转换作用，而CyclinD1 则参与G1/S 期转换进而发挥胞增殖正性调控作用［11］。MMP-2 和MMP-9 是一类依赖锌的蛋白酶，其通过降解细胞外基质和基底膜胶原蛋白在促进肿瘤浸润、转移中发挥重要作用［12］。本研究发现，干扰circMYLK可降低CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平，提高P21 表达，与功能分析相吻合，这进一步说明circMYLK 在结肠癌中的致癌作用，干扰circ‑MYLK可有效抑制SW480细胞的恶性生物学行为。
目前，多项研究研究证实circRNA 通过与miR‑NA 相互作用，使miRNA 失去自身功能，调控下游靶基因，从而影响肿瘤的生物学行为［13-14］。例如cir‑cRNA_103809 通过抑制miR-532-3p 表达减轻miR-532-3p 对 叉 头 样 转 录 因 子O4（Forkhead Box O4，FOXO4）的抑制作用进而影响结直肠癌细胞的增殖、迁移和凋亡［15］。为探索circMYLK在结肠中的作用机制，本研究通过序列分析发现miR-497-5p 可能含有circMYLK 的结合位点。miR-497-5p 属于miR-15/107 簇，已有报道显示肝细胞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌中miR-497-5p 表达下调，过表达miR-497-5p 可降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力［16-18］。本研究发现，结肠癌细胞中miR-497-5p 表达降低，过表达miR-497-5p 可降低SW480 细胞活力，抑制其迁移和侵袭能力，表明miR-497-5p 在结肠癌中具有抑癌作用，与Gharib E 等［19］研究结论相一致。进一步研究发现，过表达miR-497-5p 可降低SW480 细胞中circMYLK-WT 的相对荧光素酶活性，且circ‑MYLK 对miR-497-5p 具有负调控作用。此外，本研究发现抑制miR-497-5p 表达还可逆转干扰circ‑MYLK 对SW480 细胞活力、迁移侵袭和相关蛋白表达的影响，恢复细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这进一步说明circMYLK 在结肠癌中的致癌作用与负调控miR-497-5p表达有关。
综上所述，结肠癌细胞中circMYLK 呈高表达，干扰circMYLK 通过靶向miR-497-5p 能够抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。因此，circMYLK/miR-497-5p 分子轴是结肠癌的潜在治疗靶点，为未来结肠癌的防治提供了新的方向。
