赵 赫，李 爽，谷长勤，张万坡，程国富，刘晓丽，胡薛英*
(1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.北京伟嘉集团，北京 102206)
鸭呼肠孤病毒自然感染肉鸭的病毒分布与病理学观察
赵 赫1，李 爽2,3，谷长勤1，张万坡1，程国富1，刘晓丽1，胡薛英1*
(1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.北京伟嘉集团，北京 102206)
为了解2006-2010年湖北省地区暴发的鸭呼肠孤病毒感染的病理特征，地域性特点，运用病理剖检、常规石蜡切片及HE染色、免疫组织化学等技术对鸭呼肠孤病毒自然感染病鸭进行研究。剖检眼观病变表现为肝、脾表面出现大量黄白色病灶，组织学病变为肝、脾出血、坏死与肉芽肿形成，免疫组织化学检测结果显示所感染病鸭脾均出现特异性阳性信号，而肝和法氏囊仅部分出现阳性信号。由以上结果推测可知湖北省鸭呼肠孤病毒感染特征表现为肝脾坏死。
鸭源呼肠孤病毒；自然感染；病理变化
近年来，在中国不同地区都有发生以病鸭脾坏死为特征的传染性疾病，经病毒分离鉴定表明其病原为鸭呼肠孤病毒(duck reovirus，DRV)[1-4]。鸭呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员，病原呈二十面体无囊膜病毒，双股分节段的dsRNA核酸组成。病毒颗粒直径为60～80 nm[5]。根据流行病学、病理变化、病毒分离鉴定及试验感染结果，中国养鸭生产中与鸭呼肠孤病毒感染相关的疫病主要有以下4种：鸭多脏器坏死症、鸭多脏器出血症、鸭肝坏死症、鸭脾坏死症，其病原均为鸭呼肠孤病毒[6]。这表明中国不同地区养鸭生产中流行的鸭呼肠孤病毒感染相关的临床疫病呈现多样性、宿主差异性和地域差异性。
2006年至2010年湖北省内一些肉鸭养殖场也发生了以病鸭脾坏死为特征的传染性疾病，自发病鸭脾分离到病毒，经鉴定为鸭呼肠孤病毒[1，7]。本研究对自然感染病鸭的临床症状、剖检变化、组织病理学变化及病毒抗原定位进行观察研究，旨在进一步了解湖北省地区发生的鸭呼肠孤病毒感染的病理特征，发现其发病的地域性特点，为临床诊断及致病机制的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验动物
2006年至2010年湖北省内一些肉鸭养殖场感染病鸭，经病毒分离鉴定诊断为鸭呼肠孤病毒感染。
1．2 主要试剂
鼠抗ARV单克隆抗体，工作浓度为1∶200(由中国农业大学动物医学院微生物实验室惠赠)；SABC免疫组化试剂盒、多聚赖氨酸、DAB显色剂均购自武汉意得生物有限公司。
1．3 动物处理及组织取样
观察感染病鸭的临床症状了解发病日龄，对病鸭剖检，观察大体病变，取病鸭的心、肝、脑、脾、肾、肺、法氏囊等组织器官，10%福尔马林(3.7%～4%甲醛)溶液固定。
1．4 HE染色及免疫组织化学染色
参照文献[8]的方法进行石蜡切片以及H.E.染色。光学显微镜观察组织病理学变化。免疫组织化学方法，按SABC试剂盒所附说明书进行操作。在Nikon 80i生物光学显微镜下进行观察，用NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统记录观察结果。
2 结 果
2.1 自然感染病鸭的临床症状
感染病鸭发病日龄多在7～15日龄，有些病鸭表现不能站立，匍匐。病鸭眼周湿润，泪斑明显，羽毛松乱不齐(图1)。
2.2 自然感染病鸭的眼观病变
脾是发病肉鸭的主要病变器官，发病早期，病鸭脾表面有或突起或凹陷的黑红色出血病灶(图2A)，发病高峰期，有些脾呈黑红色，皱缩，表面和切面分布有大小不同的黄白色坏死病灶，有的病灶中央或坏死灶周围有红色出血(图2B、C)，有的整个脾呈黄白色坏死病灶(图2D)，坏死灶切开呈豆渣样(图2F)。有的脾呈表面散在分布有黄白色病灶(图2E)。
肝均有不同程度的肿大，边缘钝圆，颜色暗红，有的肝表面弥散分布大量红色出血斑点和条纹，有的肝表面弥散分布芝麻粒大小的黄白色病灶(图3A、B)。
2.3 自然感染病鸭组织病理学观察
脾红白髓界限不清，组织间出现大量的红细胞(图4A)，有的脾中分布有大小不等的坏死灶，坏死灶中央为坏死的淋巴细胞以及网状细胞，周围出现较多巨噬细胞(图4B)；部分坏死灶形成肉芽肿结构，有多核巨细胞(图4C)。肝主要病变肝组织间有聚集成团的红细胞(图4D)，有的出现局灶性坏死，呈均质红染无结构样(图4E)，坏死灶周围有炎性细胞浸润，或伴有出血，有些病变肝中出现肝细胞变性(图4F)。法氏囊内淋巴滤泡数目明显减少(图4G)，并且淋巴滤泡内淋巴细胞数目减少，有的甚至形成空洞样(图4H)，有的淋巴滤泡呈红色均质无结构的坏死灶，坏死灶内伴有出血(图4I)。肺、脑、心肌及肾主要病变为血管扩张、淤血。
2.4 病毒定位免疫组化结果
对病鸭的肝、脾和法氏囊等组织进行鸭呼肠孤病毒的免疫组织化学检测，鸭呼肠孤病毒的阳性信号出现在脾巨噬细胞、肝窦内皮细胞及变性坏死的肝细胞、法氏囊巨噬细胞及部分淋巴细胞中(图5A、B、C)，其他组织未检测出阳性信号。
3 讨 论
本研究结果表明湖北省自然感染鸭呼肠孤病毒的肉鸭主要损伤器官为脾、法氏囊和肝。脾病变为出血、坏死及肉芽肿形成，肝发生出血坏死，法氏囊发生淋巴滤泡的减少和坏死，其中脾和法氏囊病变最为明显广泛。
程安春等报道的四川云南省等地的鸭呼肠孤病毒感染主要以广泛性出血为特征[9]；胡奇林等分离到的番鸭呼肠孤病毒对樱桃谷鸭的致病性不明显[10]。黄瑜等报道的福州雏半番鸭感染在肝、脾、法氏囊病变为主，其他器官未见明显病变[11]。而番鸭呼肠孤病毒感染所引起的“肝白点”、“花肝病”等病理特征，主要以肝和脾出血、坏死为主。A.Moradian等报道禽呼肠孤病毒感染可引起鸡法氏囊发育不良、法氏囊萎缩[12]等病理现象。本研究结果显示湖北地区鸭呼肠孤病毒感染主要以脾和法氏囊坏死为主要特征，与上述报道均有相似之处。
A.不能站立；B.眼周湿润A.Unable standing；B.Moist around the eyes图1 自然感染病鸭的临床症状Fig.1 The clinical manifestations of ducks naturally infected with duck reovirus
A.脾表面分布有较大出血斑；B.脾表面分布有灰白色病灶，病灶周围有出血斑；C.脾表面分布有大小不一的黄白色病灶，病灶中央有出血；D.脾表面有较大黄白色病灶；E.脾表面散在分布有黄白色病灶；F.脾切面坏死灶呈豆渣样A.Surface of spleen with lesions as larger red spot，and gray；B.Surface of spleen with several gray lesions and lots of red spot around it；C.Surface of spleen with several gray lesions and in the middle of it have some red spot；D.Surface of spleen with a larger yellow-white lesion；E.Surface of spleen with several yellow-white lesions；F.The section of spleen is jerry-built图2 自然感染病鸭脾的病理学变化Fig.2 Gross appearance of spleen from the ducks naturally infected with duck reovirus
A.肝表面分布有大量红色出血斑；B.肝表面散在分布有大量黄白色斑点A.Surface of liver with lots of red spots； B.Surface of liver with lots of white spots图3 自然感染病鸭肝的病理学变化Fig.3 Gross appearance of liver from the ducks naturally infected with duck reovirus
A.脾局部出血；B.脾内形成坏死灶；C.脾形成肉芽肿；D.肝局部出血；E.肝局灶性坏死；F.肝坏死灶有炎性细胞浸润；G.法氏囊淋巴滤泡减少；H.法氏囊淋巴细胞减少；I.法氏囊坏死及出血A.Spleen local bleeding；B.Lesion in spleen forming focal necrosis；C.Lesion in spleen forming cysts；D.Liver local bleeding；E.Part of the liver cells cytoplasm red dye and necrosis；F.Inflammatory cells infiltration in the hepatic sinus；G.The lymphoid follicles is decrease in bursa；H.The lymphocyte was decrease in the lymphoid follicles；I.Lesion in bursa forming focal necrosis图4 自然感染病鸭组织器官的病理学变化Fig.4 Pathological changes of tissue and organ from the ducks naturally infected with duck reovirus
A.脾巨噬细胞阳性；B.肝组织肝窦内皮细胞阳性；C.法氏囊巨噬细胞及部分淋巴细胞阳性；D.脾阴性对照；E.肝阴性对照；F.法氏囊阴性对照A.In the spleen，the positive signal found in the macrophages；B.In the liver，the positive signal found in sinus endothelial cells；C.In the bursa，the positive signal found in the macrophages and part of the lymphocyte；D.The spleen negative control；E.The liver negative control；F.The bursa negative control图5 自然感染病鸭组织器官鸭呼肠孤病毒定位结果Fig.5 The results of immunohistochemical about tissue and organ from the ducks naturally infected with duck reovirus
杨旭建立了荧光定量RT-PCR方法检测鸭源呼肠孤病毒，对人工感染鸭呼肠孤病毒的体内病毒进行检测，结果显示脾、法氏囊、肺、肾、胸腺、脑等器官均检测到病毒分布，而脾病毒量最高，其次为法氏囊[13]。李爽等用SABC免疫组化方法检测了鸭源呼肠孤病毒在人工感染雏鸭体内的动态分布，发现病毒在脾、肝、法氏囊一直存在，直至7 d后才逐渐消失[14]。本试验在自然感染的病鸭脾、法氏囊和肝中发现有病毒分布，与文献报道一致，综上所述，鸭呼肠孤病毒主要分布在脾、法氏囊和肝，而脾、法氏囊和肝均是病变特征最明显的组织器官，因此推测，鸭呼肠孤病毒有可能对脾、法氏囊和肝组织呈现为一种直接性的损伤，病毒进入组织器官导致产生病理变化，且主要侵害机体的免疫器官脾和法氏囊。对鸭呼肠孤病毒感染导致的免疫损伤及免疫抑制有必要进一步深入研究。
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(编辑 白永平)
Study on Pathology and Distribution of Duck Reovirus in Naturally Infected Ducks
ZHAO He1，LI Shuang2,3，GU Chang-qin1，ZHANG Wan-po1， CHENG Guo-fu1,LIU Xiao-li1，HU Xue-ying1*
(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China； 2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China； 3.BeijingVicaGroup，Beijing102206，China)
The aim of this study was to understand the pathological characteristics of duck reovirus naturally infection in Hubei province.Pathologic autopsy，HE staining，and the immunohistochemical analysis were used to study the ducks naturally infected with duck reovirus.Results were as follows：At necropsy，large yellowish-white necrotic foci were observed in the spleens and livers.By histopathology，hemorrhagic，necrotic lesions and granulomas were seen in both organs.Immunohistochemical detection showed that all spleen samples had positive signals，but in liver and bursa only part of the samples were positive.Taken together，our results reveal that the liver and spleen necrosis is the characteristics of duck reovirus infection in Hubei province.
duck-origined reovirus；natural infection；pathological change
10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.015
2014-05-22
赵 赫(1987-)，男，河北沧州人，硕士，主要从事动物病理学研究，E-mail：zhaohe4065@qq.com,Tel:027-87286986
*通信作者：胡薛英，副教授，E-mail:hxying@mail.hzau.edu.cn
S852.659.4
A
0366-6964(2015)01-0119-05
