李延鹤，刘 军，2，3，张 涌，2，3，权富生，2，3*
(1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100； 2．农业部动物生物技术重点实验室，杨凌 712100；3．陕西省动物胚胎工程技术研究中心，杨凌 712100)
动物胚胎育种及应用中的技术策略
李延鹤1，刘军1，2，3，张涌1，2，3，权富生1，2，3*
(1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100； 2．农业部动物生物技术重点实验室，杨凌 712100；3．陕西省动物胚胎工程技术研究中心，杨凌 712100)
随着动物分子育种及动物胚胎工程技术的发展，生产、选择具有预期基因型的胚胎，已经成为现实。动物胚胎育种或动物胚胎工程技术育种将成为动物育种中一个重要的技术途径和手段。动物胚胎育种研究主要包括：(1)动物育种方案中胚胎工程技术的应用及应用中的技术选择和优化；(2)不同类型动物胚胎育种体系的建立及育种方案实施过程中防止群体近交等问题的研究；(3)动物胚胎育种遗传进展和生物安全等方面的科学评估。动物胚胎育种在应用方面的技术策略可归纳为几个方面：以扩繁为策略的胚胎育种；以转基因或基因修饰为策略的新品种创制育种；以品种种质资源保存和利用为策略的动物胚胎保种。动物胚胎育种是对传统动物育种理论的发展和完善，也是胚胎工程技术应用于畜牧生产中的体现，在加快动物遗传改良、本品种选育以及新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
动物育种；动物胚胎工程技术；动物扩繁；基因修饰；动物保种
动物育种从传统的外形选择发展到分子遗传标记辅助选择，进而出现了分子育种的理论和概念。现代生物技术的发展，使动物分子育种技术得到了提升和发展，并且在生产中得到了有效地应用[1]。“多莉”羊的出现，不仅使优秀的动物个体克隆“复制”成为现实，而且推动了动物转基因技术的迅速发展[2]。目前从实验室人为培育出了大量的试验动物和转基因家畜育种新材料[3-5]，动物育种不仅仅局限于现有群体的选育提高，同时在已知基因和性状的基础上，可通过已知类型胚胎的生产、选择和移植，以培育常规育种难于实现的动物品种或品系[4-7]。
目前，在哺乳动物上，卵母细胞的体外成熟和体外受精技术、胚胎冷冻技术、性别控制和胚胎性别鉴定技术、动物克隆和转基因技术、干细胞和多潜能干细胞(iPS)技术的研究越来越深入，有些技术日益成熟并在生产中得到普遍应用[8-9]，胚胎工程技术已成为提高家畜繁殖水平、提高家畜遗传改良、改变畜群遗传组成以及进行家畜基因功能和科学研究的主要手段和技术[10-13]，在现代分子育种技术和现代胚胎工程技术基础上提出动物胚胎育种学或动物胚胎育种的新概念，这一理论的发展，将会对现代动物育种理论和实践产生巨大推动作用。
1 动物胚胎育种的概念及其研究内容
1.1动物胚胎育种的概念
动物胚胎育种，也可以称为动物胚胎工程技术育种，就是利用胚胎工程技术和相关现代生物学技术，以动物配子和胚胎为对象进行工程化操作，达到动物育种、遗传改良以及动物遗传资源保护等目的。动物胚胎育种的实质就是利用胚胎工程技术和原理，生产预期基因型的胚胎，进而得到预期目标性状的动物育种群体。随着胚胎育种技术的发展，对动物胚胎育种理论和实践的总结将会形成一个新兴的学科，那就是胚胎育种学。即集动物胚胎学、动物分子遗传学、动物育种学和动物生殖生物学等学科和技术于一体的动物繁殖育种技术和学科。
1.2动物胚胎育种的主要研究内容
动物胚胎育种是一个新概念，其研究内容主要围绕动物胚胎育种的性质、功能和实施过程进行技术集成和生产体系的建设以及对该技术体系的整体评价，为生产应用提供技术支撑和服务。
1.2.1动物育种方案中胚胎工程技术的应用及应用方面的技术选择和优化随着生物技术的发展以及不同学科和技术的相互交叉，现代动物育种方案设计或多或少都会应用到胚胎工程技术[1，10-11，14]。胚胎工程技术的应用也确实在一些动物育种体系中发挥了显着性的作用，促进了育种进程[15]。但是胚胎工程技术，涵盖内容较多，如MOET技术、胚胎性别鉴定、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎嵌合、转基因技术、动物克隆技术等，这些技术在动物育种中如何细化、组装、集成以及有选择性的应用，以发挥胚胎工程技术最大潜力和加快动物育种的遗传进展，这是胚胎育种方案中需要最先考虑和研究的共性技术和策略问题。
1.2.2不同类型动物胚胎育种体系的建立及防止群体近交系数上升遗传退化等问题的研究胚胎育种技术策略，常常由于扩繁优良个体或者所期望基因型的动物，不可避免地会增加育种群体中相似或者相同基因型的个体比例，增加群体的近交系数[14]，将会为群体选配和选育带来麻烦，从长远来说，会影响群体选育的极限和生产水平的提高。动物的种类不同，育种的目的不同，育种方案也应该有所不同。试验动物近交系，专门用来生产相同基因型的群体，采用全同胞兄妹交配的方式来进行繁育。但是对于大多数家畜来说，选种选配中必须考虑防止近交，近交只能在较小的范围内有目的、有控制的使用[16-18]。由于不同种类动物群体对近交的耐受度不同，所以在动物育种中，采用胚胎育种的技术策略，必须根据不同种类、不同用途方向的动物，如试验动物、小型动物、中型动物和大型动物等来制定合适的育种方案，同时要将常规育种和胚胎育种方案有机结合，封闭群育种与开放系统育种有机结合，建立不同类型的动物胚胎育种方案和技术体系，以加快育种进展和提高优秀基因型个体在群体中的比例，提高动物群体特别是家畜的生产水平。
1.2.3动物胚胎育种的遗传进展以及生物安全方面的科学评估动物育种中，采用的育种方案不同，对育种的遗传进展会产生不同的影响[19]。动物群体选育提高和保种所选择的繁育方式在许多方面不同，动物选育追求的是生产能力和产品品质的提高，保种追求遗传资源和优良基因不丢失[20-21]。作为胚胎育种，目前在理论和实践上处于探索阶段，针对不同类型的动物或者育种群体，根据育种目的和选育方向，如何选择胚胎工程领域的不同技术，如何进行技术优化和集成，如何能取得良好的育种效果，还需要进行全面的评价，才能做出理性选择[22-23]。转基因育种或者基因编辑进行动物育种，需要进行生物安全评价才能进入生产阶段[9]。胚胎育种的优越性，需要和常规育种进行全方位的比较，在实践中不仅要进行经济性状改良效果及效益的评估，同时还要进行对应用胚胎育种技术产生的问题、存在缺陷、不利影响、潜在的生物风险和危害等问题进行相关研究[14，22-23]，提出解决的途径和方法，为胚胎育种技术的设计和改进以及生产应用提供安全、可靠的依据。
1.3动物胚胎育种涉及的胚胎工程技术及学科
按动物胚胎工程技术的发展来分，分为传统胚胎工程技术和现代生物胚胎工程技术。传统胚胎工程技术：胚胎移植技术、胚胎体外生产技术、胚胎性别控制技术和性别鉴定技术、卵母细胞和胚胎冷冻技术等。现代胚胎生物工程技术在传统胚胎工程技术的基础上，还包括动物克隆技术、动物转基因技术、动物胚胎干细胞技术等[1，8，24]。胚胎育种是胚胎工程技术在动物育种中的生产应用，传统胚胎工程技术和现代胚胎工程技术在胚胎育种中往往相互结合，综合应用。
按胚胎工程的技术流程和程序，分为上游技术、中游技术和下游技术。上游技术：动物遗传标记技术、数量遗传技术、外貌选择技术以及转基因动物制作载体构建等特定基因型、优良表型个体选择和转基因动物上游工作所涉及的有关技术等[1，9，12，16，25-26]。中游技术：特定基因型胚胎生产相关技术，如超数排卵、胚胎体外生产(卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎早期培养)，胚胎性别鉴定、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎嵌合、体细胞核移植等技术[1，8，10，27]。下游技术：胚胎移植技术(包括同期发情技术)、妊娠诊断技术、后代鉴定及育种值预估和生物安全性评价(包括后代基因型鉴定、生产性能鉴定和生物安全性评价等)[12，14，16，22-23]。
所以胚胎育种是一项综合技术，涉及的学科领域有动物遗传学、动物育种学、动物分子生化、动物细胞学、动物繁殖学、胚胎生物学等学科[1]。
2 动物胚胎育种的技术策略和生产应用
2.1以扩繁为策略的胚胎育种
主要以理想型个体扩繁为目的，理想型个体可以是新品种或者优秀个体，也可以是遗传标记已知的理想基因型或者转基因个体，也包括一些濒危动物，通过扩繁的手段达到提高理想型个体数量或者特定基因型群体数量比例的目的。
2.1.1理想基因型或者已知基因型选择策略 动物遗传标记、全基因组选择、动物线性模型无偏估计(BLUP法)、动物指数育种等。动物胚胎育种和传统动物育种一样，优良个体和理想基因型个体的选择是育种的前提和保障。随着动物分子育种以及应用数学等学科的发展，动物选种的技术不断提高，从表型选择到分子标记、基因选择，选择的准确率以及选择的效果都得到了明显的提升[25，28-30]。选种的方法包括动物遗传标记、全基因组选择、动物线性模型无偏估计(BLUP法)、动物指数育种等。这些技术和方法的应用，对动物胚胎育种很重要。
2.1.2MOET(超数排卵和胚胎移植)技术扩繁策略动物胚胎育种中，一般首选技术为MOET技术，这是胚胎工程技术中最基础、也是最成熟的技术，国内外在家畜育种和群体扩繁中应用最广泛，在绵、山羊扩繁育种、奶牛和肉牛育种中有较多的报道[14，16-17，19-20]。笔者所在实验室，在2002-2006年，在国内开展了牛羊胚胎规模化生产技术体系研究和应用，先后在16个省市自治区进行规模化牛、羊胚胎移植，共计移植受体牛35 689头，获得妊娠受体牛17 865头(50.03%)，产犊存活16 972头，移植受体羊35 879只，获得妊娠受体羊22 245只(62%)，产羔存活21 133只，大大推进了荷斯坦奶牛、红安格斯肉牛、波尔山羊以及无角道赛特肉羊的推广和改良[31-33]。
2.1.3其它胚胎工程技术应用动物胚胎体外生产技术，包括JIVET技术(幼龄家畜体外胚胎生产技术)、性控胚胎生产、精子胞内注射等。为了进一步提高家畜的繁殖效率，国内外对各类家畜，尤其牛羊的体外胚胎生产进行了大量的研究[11-12]，同时对幼龄母畜超数排卵和胚胎体外生产技术进行了研究[34]。在性控胚胎体内外生产以及胚胎冷冻等相关技术也进行了研究，促进了胚胎工程技术的进步和家畜育种技术的发展。据国外报道，利用活体采卵技术可以显着提高胚胎移植育种体系的效率，一头高产奶牛，在一年内采用重复超排和采卵，可以收集到1 000枚卵母细胞，体外成熟和受精、体外培养后，可获得300枚可用胚胎，显然这种繁殖体系效率更高，可以使优秀母牛的繁殖和遗传潜力得到更大的发挥[15]。笔者所在实验室，从1998年开始，就致力于胚胎体内外生产和技术优化。目前已经优化了牛活体采卵技术，卵母细胞体外培养条件、体外受精方法和胚胎体外培养体系，建立了良种牛胚胎体外规模化生产技术。从2002-2006年，先后生产体外受精囊胚15 192枚，囊胚体外发育率稳定在40%以上，先后用性控精液体外受精生产性控胚胎9 622枚，移植9 622头受体，妊娠3 431头，妊娠率为36%。受体产犊牛3 159头，其中雄性犊牛316头，雌性犊牛2 843头，性别符合率为90%，发明了奶牛胚胎性别鉴定简易方法[35]，先后共鉴定体外受精胚胎15 192枚胚胎，移植7 898枚雌性胚胎，移植受体7 898头，妊娠2 867头，妊娠率为36.3%，产犊2 754头，全部为母犊。鉴定准确率为100%；鉴定了体内胚胎24 368枚，雌性胚胎12 184枚，移植受体12 184头，妊娠5 508头，妊娠率为45%，最后产牛犊5 460头，其中公牛犊2头，母牛犊5 458头，鉴定性别准确率为99.9%。随着动物胚胎体外生产技术的优化和成熟，动物胚胎育种在家畜育种中将会发挥越来越重要的作用。
2.1.4动物克隆技术扩繁优秀个体或基因型个体策略动物克隆或者体细胞核移植技术对于扩繁相同基因型个体以及生产顶尖级的优秀种畜非常有意义。国内外相关报道也较多[8-12，36]。本实验室的研究团队，近年来，从供核细胞和卵母细胞选择、表观遗传修饰以及核移植重编程机理等方面进行深入的研究，优化了体细胞核移植技术体系，研制出了牛体细胞高效克隆技术，克隆年产奶量在10 000 kg以上的奶牛513头，226头对乳腺炎非易感的高产奶牛，使牛体细胞克隆胚胎移植后的受体产犊率由过去的5%左右提高到20.36%[35，37-39]。
2.2以转基因或者基因修饰为策略的新品种创制育种
国内外利用转基因技术已经创制了上百种动物育种新材料或者新品种(系)，包括一些新的试验动物模型、试验动物突变近交系的培育等[40]。采用假性attP位点定点插入技术和Cre/LoxP可控切割技术，目的基因以单拷贝形式整合在牛体细胞基因组假性attP位点，得到无抗性筛选标记的转基因细胞系。通过体细胞克隆，获得41头转基因奶牛。乳头管内注射细菌液后检测证明转基因牛乳腺可有效抵抗葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的感染[6]。刘旭采用锌指核酸酶介导的基因打靶技术，将溶葡萄球菌素基因插入牛体细胞的β-酪蛋白基因座，经药物筛选得到阳性细胞用于体细胞核移植，生产溶葡萄球菌素基因打靶的克隆牛8头，经检测，这8头转基因牛均在牛β-酪蛋白位点整合了溶葡萄球菌素基因，并在其乳腺组织中正确表达。乳头管内注射细菌液后，检测证明转基因牛乳腺可有效抵抗金黄色葡萄球菌的感染[4]。将人溶菌酶基因插入牛体细胞的β-酪蛋白基因座，经药物筛选得到阳性细胞用于体细胞核移植，生产人溶菌酶基因打靶的克隆牛5头，经检测，这5头转基因牛均在牛β-酪蛋白位点整合了人溶菌酶基因，并在其乳腺组织中正确表达。乳头管内注射细菌液后检测证明转基因牛乳腺可有效抵抗葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的感染[41]。吴海波采用TALEN介导的基因打靶技术，将巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)启动子和SP110基因定点插入到牛成纤维细胞的肺表面活性蛋白A(SP-A)与蛋氨酸腺苷转移酶Ι(MAT1A)之间，将中靶细胞作为核供体进行体细胞克隆，研制出SP110基因打靶抗结核克隆牛18头。经转基因牛巨噬细胞体外攻菌试验、转基因牛体内攻菌试验和小样本接触传染性试验，证明SP110基因打靶牛对结核分枝杆菌有显着抗性，抗病力提高70%以上。可作为抗结核病新品种牛培育的育种材料[5]。
目前转基因育种所采用的关键技术：基因编辑技术，如基因打靶、基因插入、基因敲除、基因替换等。同时结合核移植技术或者基因显微注射技术以及干细胞或者iPS技术等，导入外源基因于动物基因组中，创制新的动物育种新材料[42-44]。
2.3以品种种质资源保护和利用为策略的胚胎保种
主要针对一些濒危动物或者种质资源独特的经济动物或者野生动物进行遗传资源保存或者克隆出所期望的后代[13，45-48]。
利用的关键技术：动物组织或者体细胞体外培养和保存技术；卵母细胞和胚胎冷冻保存技术；动物体细胞克隆技术(包括动物异种克隆技术)[49]。
在所有胚胎育种策略中，育种者根据育种目标、技术条件以及育种动物的特点，选择所需具体技术，如性别控制、性别鉴定技术、胚胎遗传诊断技术、精子显微注射技术等，进行相关技术的集成和综合应用，获得所期望性状或者基因型的育种动物，实现动物育种的目标。
3 动物胚胎育种的优势和展望
目前在动物育种方面，由于杂交优势利用的需要，从重视新品种培育已经发展到重视不同品系(近交系、专门化品系等)的培育[26，50]，对于不同品系的培育，利用胚胎工程技术有得天独厚的优势，如试验动物近交系的培育，无菌动物培育等。在动物育种上，数量遗传学所采用的各种方法，从表型来推断其可能的遗传性能。尽管近年来分子遗传标记、辅助选择技术有很大的发展，并应用于数量遗传学方面，但是选择的是主效基因或者连锁基因，需要用较大的样本来建立其选择体系，抽样误差一般比较大，而且选种不一定很准或者很确定。目前在家畜选择上直接针对影响数量性状的多基因选择及利用遗传标记辅助选择、全基因组选择，在基因型明确的基础上，直接预测其表型或者相对表型，这正是胚胎育种在动物育种方面的优势所在，即针对某一明确的基因型或者主效基因表现明显的个体或者类群进行扩繁育种，得到生产性能和表型一致的群体(品系或者新品种)[26-27，45，50-52]，对动物育种进程会起到明显的推动作用。
群体遗传或者传统育种学是通过表型来选择理想个体，遗传标记技术的出现，作为表型选择的辅助手段，大大提高了选择的准确性，但是这种选择遗传进展很慢，因为一个群体的遗传组成很稳定，特别是大群体，基因频率世代间变化符合Hardy-weinberg定律，物种内基因组保守性很强，所以靠自然选择发现新的变异很难，也比较慢。直接通过转基因或者基因修饰得到符合要求的新的变异体或者新材料比较容易实现。但是胚胎育种只是作为加快育种进程或者育种新材料创制的一种手段或者一个中间过程，要培育出一个新的品种或者育种新类群，需要常规育种技术方法的配合，最终还需通过常规育种和自然扩繁完成新品种的培育，达到一定的数量和群体，并且具有一定的遗传稳定性。当然在常规育种中，通过遗传标记或者分子标记技术，计算机模拟育种、数学线性模型选择手段，简化育种程序，缩短育种时间，以加快育种进程[10，24]。所以现代胚胎育种是对传统育种理论和方法的补充和完善，是对传统意义上动物育种理论和方法的创新性发展。进行胚胎育种理论和方法的深入研究具有重要意义，进行胚胎育种的生产应用对于家畜育种将会起到积极的促进作用。
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(编辑程金华)
Technical Strategies of Animal Embryo Breeding and Its Application
LI Yan-he1，LIU Jun1，2，3，ZHANG Yong1，2，3，QUAN Fu-sheng1，2，3*
(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.KeyLaboratoryofAnimalBiotechnology，MinistryofAgriculture，Yangling712100，China；3.AnimalEmbryoEngineeringTechnologyResearchCenterofShaanxiProvince，Yangling712100，China)
With the development of animal molecular reproduction and embryo engineering technology，the production of genetically superior offspring has become a reality.The embryo engineering technology of animal embryo reproduction has been becoming an important technical approach in animal reproduction fields.The studies of animal embryo breeding include：1) the selection and optimization of embryo engineering technology in animal breeding program；2) the establishment of different systems of animal embryo breeding and the solution exploration of the issues of animal breeding such as inbreeding avoidance；3) the scientific assessment of genetic progress and biosafety in animal embryo breeding.The applications of these technological strategies in animal embryo breeding can be summarized as following：the purebred breeding through expanding group of outstanding individuals；the breeding of new varieties by transgene or gene modification technique；the breeding conservation by using animal germplasm resources.The technology of animal embryo breeding is the development and improvement of the traditional animal breeding theories，as well as the reflection of animal embryo biotechnology application in real animal production.This animal embryo breeding technology has broad application prospects in accelerating the development of animal breeding，the breeding selection，and cultivating new varieties.
animal breeding；animal embryo engineering technology；animal reproduction；genetic modification；animal conservation
10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.002
2015-12-09
国家高技术研究发展计划课题(2011AA100303)；陕西省农业科技攻关项目(2014K02-07-02)
李延鹤(1991-)，男，山东烟台人，硕士生，主要从事早期胚胎发育研究，E-mail：liyanhe1212@163.com
权富生，教授，博士生导师，E-mail：quan3145@163.com
S814
A
0366-6964(2016)10-1954-07
