王延新，谢书宇，陈冬梅，王玉莲，潘源虎，彭大鹏，陶燕飞，袁宗辉
(华中农业大学，国家兽药残留基准实验室(HZAU)农业部食品安全评价重点开放实验室，武汉 430070)
从古至今，食品就是人们得以生存和发展的物质基础[1]，而食品安全问题与人类健康和民生等重大问题息息相关，近年来食品安全问题更是层出不穷。为解决食品安全问题，给人民提供健康可食的制品，急需实现对食品的快速检测，研发更先进更具优势的食品安全检测技术愈显重要。目前，食品安全检测主要依赖于仪器方法，主要包括HPLC、LC-MS/MS、GLC、GC/MS/MS等，但是仪器方法存在成本昂贵、操作复杂、检测时间长、无法实现速测现场检测和需要专业操作人员等缺点[2]。然而与上述仪器检测技术相比，免疫传感技术具有下列长处[2]：一是抗原-抗体的特异性作用使得免疫传感器具有高灵敏度，即特异性高；二是基于修饰电极的纳米质优良的电化学特征使检出限明显降低；三是检测过程耗时短，历时以分钟计；四是免疫传感器造价较低、易于推广使用、轻巧便于携带，操作程序简易而不需专业培训。电化学传感器在食品安全检测的应用研究中，对免疫传感器的研究相对最早，种类最多，发展也相对成熟[3]。免疫传感器联合各种电化学分析技术，如溶出伏安法、脉冲伏安法、差分脉冲法等，大大提高了物质检测的灵敏度[3]。此外，在电化学生物传感器的构建过程中，由于碳纳米材料具备稳定的化学性能、大的比表面积、良好导电性和生物兼容性等优点，可选为良好的电极修饰材料而优化传感器性能，即通过降低目标检物的氧化过电位，增加峰电流，从而提高该检测方法的灵敏性。在短短几十年里，相继开辟了种类繁多的研究和应用领域，其中在食品安全领域中毒素、抗生素、杀虫剂和病原微生物等的测定，成为替代传统检测方法可广泛应用的潜在技术之一[4]。
作者综述了碳纳米材料在电化学生物传感器中的应用以及近五年来电化学免疫传感器用于食品安全领域中真菌毒素、药物残留、农药残留等物质的快速检测的研究应用情况，以期使研究者们对电化学免疫传感器在食品安全检测中的开发、研究、应用有深一步的理解和领悟，使电化学免疫传感器在食品安全检测领域有长足发展，给社会和人民带来可观的福利。
1 碳纳米材料及其性能
自从1984年，纳米材料被德国物理学家Gleiter发现以来，成功引发了科学家们极其浓厚的研究开发兴趣。以下我们将重点介绍碳基纳米材料家族(碳纳米管、石墨烯、碳纳米点、石墨烯量子点)及其在电化学传感器制作中的广泛应用[5]。
1.1 石墨烯
石墨烯是由碳原子sp2杂化构成六角形并依次平面连接形成蜂窝晶格状层的二维材料，碳原子的sp2杂化键长0.142 nm，而其厚度为0.34 nm，相当于单个碳原子层的厚度，正是由于石墨烯的这种优异的结构构成，赋予它各种优良性能，如极好的导电性、大的电子迁移率、较高的比表面积(26～30 m2·g-1)等，这些特性使其在生物医药、电子信息等范畴具有可观的应用开发前景。比如，Wen等[6]基于十六烷基三甲基溴化铵活化剂修饰的石墨烯与壳聚糖构成的纳米复合材料修饰电极，所构建的安培型生物传感器对NO的检出限为6.75×10-9mol·L-1，并成功地用于油菜叶片匀浆样品中NO的检测。张晶晶等[7]把牛血清白蛋白标记的微囊藻毒素(BSA-MCLR)成功偶联到石墨烯纳米片层(GS)上构建了检测微囊藻毒素的电流型免疫传感器，并以纳米金(AuNPs)作为探针检测反应信号，在最佳实验条件下的线性范围为0.1～50 μg·L-1，检出限为0.05 μg·L-1。石墨烯作为优良的碳纳米材料对电极进行修饰所构建的生物传感器对无机物和有机物都实现了良好的检测效果，并被成功地应用于实样中的检测。此外，石墨烯的制备方法经改良后流程越加明晰简单，使得其来源充沛，造价降低，可作为制备生物传感器的首选碳纳米材料之一。
1.2 碳纳米管
碳纳米管(CNT)是以石墨烯的片层结构为基本单位并依照特定的角度螺旋卷曲而成的单层或者多层的网状中空结构，其中含有大量的sp2杂化碳原，通过共价键合作用使碳纳米管功能活化而带有一些活性基团，如羧基、羟基等，从而进一步改进碳纳米管的优异电化学性质。朱作艺[8]通过将碳纳米管羧基功能化并与离子液体掺杂聚苯胺复合修饰到电极表面成膜，用该修饰电极对多巴胺展开了电催化氧化研究，并成功实现了在高浓度尿酸、抗坏血酸环境下对多巴胺的特异性检测。杨素玲[9]基于功能化多壁碳纳米管与Nafion共价结合构成复合膜修饰到玻碳电极表面(MWCNTs/Nafion/GCE)，该修饰电极在对弱碱性弱酸性药物的定量分析中，通过提高药物分子的氧化峰电流降低氧化过电位成功构建了一种伏安法定量测定咖啡因、茶碱、丹皮酚、抗坏血酸和尿酸的高灵敏度检测系统。Malhotra等[10]通过活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)将富含羧基的单壁碳纳米管功能化后，将抗体分子通过共价键合固定到碳纳米管阵列上，基于碳纳米管优良导电性能成功构建灵敏度大大提高的检测癌症标记物(IL-6)的免疫传感器。
1.3 碳纳米点与石墨烯量子点
在碳纳米管和石墨烯被广泛应用的同时，碳纳米点(CDs)和石墨烯纳米点(GQDs)是一种相对较新的具有发光性能的碳基纳米材料。碳纳米点是一种非晶态或晶态的准球形碳纳米粒子，直径小于10 nm[11]。石墨烯量子点具有石墨烯的晶格结构，原子层数较少，横向尺寸在3～20 nm范围内[12]。碳纳米点和石墨烯量子点的发光可能源于表面激子的辐射复合和量子约束效应,其发光性与量子点(QDs)相当，具有很高的稳定性和可调谐性[13]。但碳纳米点和石墨烯量子点比量子点更环保，因为碳基材料一般毒性很低，且易由可再生资源合成，如碳水化合物、果皮和甘蔗渣[14]。此外，碳基纳米材料通常是可生物降解的，在体内可被过氧化物酶分解。由于这些特性，CDs和GQDs可以作为荧光探针或在生物传感器中作为FRET供体使用[15]。
2 电化学免疫传感器在食品检测中的应用
2.1 真菌毒素的检测
真菌毒素是由真菌产生的小分子、高毒性次级代谢产物，通常以痕量形式存在于基质中，不表现为急性毒性，但具有蓄积性，长期摄入易引发癌症、突变及畸形，从而对人类安全造成威胁[16]。真菌毒素对农产品的影响广泛，尤其是谷物和谷物食品[17]。自20世纪60年代初首次发现黄曲霉毒素具有致癌作用以来，大多数国家以及欧盟已经制定了严格的预防措施以减少食品污染问题，并规定了食品中霉菌毒素的允许检出水平。现今，真菌毒素常用仪器分析方法，其通常需要复杂的仪器及样品前处理[18]。而真菌毒素的电化学生物传感器使用特异性抗体、适体、受体和分子印迹聚合物作为亲和配体，显示出潜在的用途[19]。
近年来，免疫传感器逐步成为真菌毒素快速检测最活跃的研究领域之一，具有重要的经济价值和社会价值。比如，周琳婷等[20]研发的黄曲霉毒素B1(AFB1)阻抗型电化学免疫传感器成功用于花生样品中AFB1的痕量检测，并且经考察该方法的灵敏度和稳定性均优于现有的文献报告。干宁等[21]研制了一种安培免疫传感器并用于小麦粉中AFB1的检测，响应电流与AFB1浓度在1.0～200 μg·L-1范围内呈良好的线性关系，此外组内组间变异系数均低于3.5%，回收率为97%～104%，检测限为0.3 μg·L-1， 该传感器缩短了样品温育所需时间，为免分离一步测定AFB1的现场检测提供了可能性。Zhang等[22]构建了一种基于单壁碳纳米管/壳聚糖修饰电极(SWNTs-COOH/CS/GCE)用于AFB1检测的间接竞争型电化学免疫传感器，在最佳条件下，该方法的检测范围为0.01～100 ng·mL-1，检测限为3.5 pg·mL-1，并成功应用于实样玉米淀粉中AFB1的检测，与高效液相色谱法(HPLC)的检测结果高度一致，与传统检测方法相比较其灵敏度更高，操作更简易。张弦等[23-24]依据间接免疫竞争原理，将游离的赭曲霉毒素A(OTA)和赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白(OTA-BSA)与一定量的OTA单克隆抗体竞争结合，成功研制了一种用于OTA快速测定的电化学免疫传感器，线性范围为0.01～100 ng·mL-1，检测限为4 pg·mL-1，低于意大利规定的最低检测值(0.5 μg·kg-1)，该传感器将成为OTA在食品安全领域中实现快速定量检测的有力技术方法。Yang等[25-26]基于单壁碳纳米管/壳聚糖复合材料(SWNTs/CS)构建的电化学免疫传感器，可以高效特异地检测玉米样品中FB1的含量，线性范围为0.01～1 000 ng·mL-1，检出限可达 2 pg·mL-1，远低于欧盟立法规定的最低检出限(2～4 mg·L-1)。此外，该传感器用于检测人为添加FB1以及天然污染FB1的玉米样品，均获得良好的回收率(96.34%～115.95%)，且与HPLC的检测结果具有良好的一致性。该免疫传感器以其优异的灵敏性、特异性和重现性，将成为未来农业及食品安全领域中以市场为导向定量检测 FB1的一种潜力工具。
2.2 抗生素残留的检测
抗微生物药物广泛应用于动物疾病的预防和治疗，同时还可以促进动物的生长并提高饲料的利用率。然而，科学文献表明可能存在动物源性食品中抗菌药物残留，使它成为一个公众关注食品安全的关键。因此，设计快速准确的动物源性食品中抗菌药物残留监测方法十分必要。许多国家已经制定了立法，以确保抗菌药物的残留量小于最大残留限量(MRL)。在这一背景下，近年来，电化学生物传感器以其独特的分析特性在食品安全领域引起了人们的特别关注[27]。以下对电化学生物传感器监测动物源性食品中抗菌药物残留的研究进展进行了简单概括。
近年来，抗生素生物传感器也取得了一定的发展，由于其灵敏度高、分析速度快、操作简便、易于集成和微型化、制作成本低廉等特点，已经被广泛应用于抗生素的检测研究中。其中用于检测抗生素的生物传感器主要有免疫传感器和酶生物传感器。例如，韩志钟等[28]构建青霉素酶-氧化苏木精修饰Au/ZnO/GN(PH-AZG)的电流型传感器在PBS水溶液(pH=7.0)中对青霉素钠检测线性范围为2.5×10-14～3.3×10-6mol·L-1，检出限达到1.5×10-14mol·L-1，并有较高的选择性和稳定性。同时还实现了对实际牛奶制品中低浓度青霉素钠的检测，在 5×10-14～5×10-7mol·L-1范围内有显着的响应值。阙小华[29]用氧化石墨烯做基底，原位生成铂-石墨烯复合纳米材料，并作为小分子半抗原标记物，构建竞争型免疫传感器。在优化实验条件下,该竞争型电化学免疫传感器电信号对四环素标准品浓度成反比变化，线性范围是0.05～100 ng·mL-1，检测限为6.0 pg·mL-1。Moraes等[30]制备了一种基于垂直排列的单壁碳纳米管(SWCNTs)电化学传感器，并用于左氧氟沙星的检测。该传感器利用π-π 堆积作用将单链 DNA(ssDNA) 与 SWCNTs 进行杂化后，自组装于金电极表面。该有序组装的表面对左氧氟沙星的电氧化行为展现了良好的选择性和较高的电催化活性，检测限达到75.2 nmol·L-1。该电化学传感器已被成功应用于尿液中左氧氟沙星的检测。Borowiec等[31]合成了一种氮掺杂石墨烯修饰的纳米金复合材料(Au/N-G)，滴涂于玻碳电极表面。氯霉素在该电化学传感器上的电化学行为表明Au/N-G具有良好的电子传递能力，有效提高了氯霉素检测的伏安响应，检测限为 0.59 μmol·L-1。该 Au/N-G 电极制备过程简单快速，且具有良好的重复性与稳定性。在实际样品的检测中，该传感器对氯霉素滴眼液中氯霉素含量的检测结果(2.05 mg·mL-1) 与传统的 HPLC 法(2.07 mg·mL-1)一致。Wang等[32]开发了一种基于AuNPs/cMWCNTs的新型分子印迹电化学传感器(MIECS)，并应用于OLA的痕量检测。在优化条件下，MIECS对OLA具有高灵敏度和选择性，检测限为2.7 nmol·L-1，实际样品(猪肉和鱼肉)中检测OLA时，回收率高达80.7%～115.8%，相对标准偏差(RSD)小于11.4%。Xu等[33]利用多壁纳米碳管修饰玻碳电极构建简易且具有高灵敏度的电化学方法并用于喹乙醇的检测，检测范围与检测限分别为0.3～180 μg·mL-1、0.26 μg·mL-1，RSD为3.5%，在考察中展现了良好的重复性和抗干扰性。
2.3 农药残留的检测
有机磷农药(OPPs)、氨基甲酸酯类农药(CBs)、拟除虫菊酯类农药(PYRs)和三嗪类除草剂(TRZs)等农药可以消灭虫害从而增加谷物产量，目前在农业生产中比较常用[34]。但是大多数农药具有生物蓄积性风险和对人类的毒性相对较高的共性[35]。近年来，生物食品安全问题越来越受关注，农药残留成为危害食品安全的重要问题之一，这对快速检测农药残留提出高要求，研究方便、快捷的检测农药残留方法已成为当务之急[36]。生物传感器技术作为一种新的检测分析仪器，在食品检验的领域具有广阔的应用前景[37]。
有机磷农药由于在环境中的半衰期较短，对哺乳动物毒性相对较低，应用范围广泛，价格低廉等优点，占据了绝大多数市场[38]。Mehta等[39]基于功能化的石墨烯量子点构建了丝网印刷电化学免疫传感器，并用于硫磷的测定，线性检测范围是0.01～106pg·mL-1，检测限为46 pg·mL-1，对其稳定性、响应重现性和再生性的考察充分支持了它潜在的实用性。Liu等[40]将单壁碳纳米管与重氮盐分子修饰电极，通过修饰材料表面稳定的共价键将对氧磷单克隆抗体涂层稳定修饰到电极表面，从而成功构建了基于芳香重氮盐单分子层和单壁碳纳米管修饰的对氧磷电化学免疫传感器。该传感器具有较强的特异性和很高的灵敏度，检测范围为2～25 000 ng·mL-1，检出限可达2.0 ng·mL-1，能实现对氧磷的现场检测，具有较大的市场应用潜力。再如，Belkhamssa等[41]研发了一种快速、一次性、无标记免疫传感器用于莠去津除草剂的测定，在最佳条件下，线性范围为0.001～10 ng·mL-1，检测限为0.001 ng·mL-1，回收率为87.3%～108.0%，并且可用于环境中莠去津的低浓度检测。
2.4 致病菌的检测
对细菌细胞检测分两种：(1)检测特定的细菌种类或菌株，(2)总菌数，即样品中所有种类的细菌总数。检测特异性细菌和细菌总数与细菌细胞壁的分子相互作用有关。在大多数革兰阴性细菌中富含肽聚糖、蛋白质、脂多糖(LPS)以及支链酸(主要是革兰阳性细菌)。特异性细菌的检测依赖于特异性分子受体(抗体/适配体)与细菌抗原(细胞壁上的蛋白质和脂多糖)的结合。而计细菌总数利用了细菌之间的共性，例如静电作用下细菌细胞壁的表面电荷特性，或细菌细胞壁上的糖类与糖类结合分子(凝集素或硼酸)。细菌细胞壁含有细菌抗原(特定细菌种类或菌株特有的蛋白质和脂多糖)，这种抗原可以被特定的抗体或适配体识别。将相应的抗体/适配体作为分子受体与纳米材料结合从而实现特定细菌的检测。利用两个不同吸光度的mNPs，如金纳米棒(AuNRs)，可在30 min内对多种细菌(如大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌)进行多重检测(10～108cfu·mL-1)，该设计提供了快速、简单的混合检测方法。结合QDs或MNPs的抗体被用于湖水样品中大肠杆菌、食品样品中金黄色葡萄球菌、食物提取物或复合液体(牛奶、血清、尿液)中鼠伤寒沙门菌的检测[42-45]。
2.5 其他物质的检测
电化学生物传感器因其具有操作简单、响应时间短、灵敏度高、成本低等诸多优势，在临床分析(标记物、肿瘤细胞、病毒)[46-47]的快速检测中的应用也渐渐发展起来，近几年尤盛。相关情况见表1。
表1电化学生物传感器在其他物质中的检测应用
Table1Applicationofelectrochemicalbiosensorsinothersubstancesdetection
目标检测物Target检测限LOD检测范围Detection range电极表面Surface参考文献Referenceα-fetal protein (AFP)0.33 fg·mL-11～80 ng·mL-1GCE/grox/chit-fuller-ene/Ab1Zhang等2016[48]SOX27 fg·mL-125 fg·mL-1～2 pg·mL-1CTES/ ITO/anti-SOX2 AbAydin和Sezgintürk, 2017[49]Cardiac marker0.01 ng·mL-10.01～100 ng·mL-1GQDs/SPEs/anti-cMyo AbTuteja等, 2016[50]MAGE-11.30 fg·mL-14～200 fg·mL-1CTES/ITO/ anti-MAGE-1Gündoˇgdu等, 2017[51]Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A)0.11 pg·mL-10.27～268 pg·mL-1Au/GR/CS/GCEAfkhami等, 2017[52]Human ovarian cancer (SKOV-3) cells5.2 cells·mL-16.5～65 000 cells·mL-1GCE/GO/anti-HER2Xia等, 2012[53]Human breast cancer (MCF-7) cells and adri-amycin-resistant MCF-7 (MCF-7/ADR) cells170 cells·mL-15×102～1.6×106cells·mL-1(Bcl-2)-BSA/PLL/GCEChen等, 2015[54]Human cervical carcinoma (HeLa) cells10 cells·mL-110～106 cells·mL-1Au/MPA/PEI-Fc/SWCNT/FALiu等, 2013[55]
3 总结与展望
作者综述了纳米粒子支持和增强免疫化学生物传感领域的最新进展、挑战和发展趋势。该研究主题展现了跨学科的科研努力，即将纳米粒子独特的电子、磁性、光学、催化和力学特性与具有优秀识别功能的生物元件(如抗体)结合起来的应用研究，介绍了纳米材料广泛的应用背景，并讨论了纳米粒子在免疫传感中的作用。此外，本文还主要对近几年电化学免疫传感器在生物学领域中分子水平、细胞水平的物质检测的应用情况进行了概括，虽然免疫分析技术在三十多年前就已出现，但是现在仍有很多研究者致力于电化学免疫分析及免疫传感器的研究。免疫分析技术与电化学检测相结合的体系是更简单、更快、更经济的拥有高灵敏度、高特异性的分析方法，但该方法存在稳定性差、装置构成复杂等缺点，使其在现场检测和便携优势还未充分发挥作用。
目前，该领域的研究人员似乎集中精力于传感器最佳性能限制的实现，即小分子水平上的最低检测阈值。然而，其他易被忽略的方面也是至关重要的，比如整个分析过程持续时间(从样品的分析到结果的读取)长。高灵敏度和极低的测量浓度确实是很好的指标，但它们应始终与实样中的实际需要和样品中分析物的现有水平进行比较。
所以，我们至少需要从三个方面进行考虑：(1)克 服抗原抗体在电极表面固载的稳定性问题，选取合适的结合方法提高电极表面抗原抗体的稳定性；(2)保持探针稳定优异的功能化性能使得对物质的检测更加精确稳定；(3)把理想实验室条件下的检测结果实际应用到实样的检测中去，实现便携式的快速检测技术的市场化需求。总之，希望在不久的将来免疫传感器技术在各领域中都有长足的发展，使得人们食有所保。
