禽白血病病毒在惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡的垂直传播特性分析

张会永，吴井生，李国辉，俞 燕，杨剑波，苏一军，殷建玫，韩 威*

(1.中国农业科学院家禽研究所，扬州 225125；2.江苏农林职业技术学院，句容 212400)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma virus，ALV)引起的禽类(主要是鸡)各种良性和恶性肿瘤的一类疾病。禽白血病病毒依据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异、病毒干扰试验、宿主范围和基因组分子生物学特性将其划分为10个亚群(A～J亚群)[1-2]和新发现的K亚群[3]，其中A、B、C、D、J亚群属于外源性病毒，对鸡生产影响较为严重的是A、B和J亚群[4-6]。

ALV可水平和垂直传播[7-8]。水平传播主要通过出雏和育雏期羽毛、粪便等接触传播，整个饲养过程中疫苗免疫也是主要传播途径之一。已有的研究表明，ALV可通过母鸡和公鸡进行垂直传播，但是，公鸡、母鸡在ALV垂直传播给下一代所起到的作用至今没有相关报道。Tsukamoto等[9]研究发现ALV可通过母鸡输卵管传播给胚胎，Payne和Nair[10]报道也表明ALV-A、ALV-B和ALV-J均可通过母鸡垂直传播给后代。Segura等[11]、Smith和Fadly[12]研究认为禽白血病病毒不能在公鸡的生殖器官中增殖，公鸡仅作为病毒载体，在交配过程中传播给后代。张培培[13]在仿土蛋鸡群J亚型禽白血病病毒的感染状态评估及其来源探究中发现，后代分离到的ALV-J毒株与其父本ALV-J分离株的gp85基因序列相似性达98.5%～99.7%，表明其来源于父本。俞燕等[14-16]在地方鸡种公鸡精液检测中发现有ALV，Li等[17]研究发现公鸡可通过精液将ALV垂直传播给后代。

针对鸡遗传资源保种场、基因库而言，由于单个保种群规模较小(一般30～40个家系，抢救性保护群体数量更少)，若淘汰全部带毒个体或家系(尤其是数量较少的公鸡)，会导致群体规模骤减，造成遗传多样性丢失和近交系数过快增加。基于此，我们以惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡为素材，对阳性公、母鸡垂直传播特性进一步验证探讨，旨在为优化种禽场、保种场禽白血病净化方案提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡均来源于国家级地方鸡种基因库(江苏)，43周龄时进行禽白血病血液和精液病毒分离检测，筛选个体组建以下试验组：(1)阳性惠阳胡须鸡♂×阴性汶上芦花鸡♀(♂3只，血液病毒分离S/P值分别为0.877、1.856、4.328；♀分3小 组，每组8只)；(2)血液和精液病毒分离检测均为阴性的汶上芦花鸡♂×阳性惠阳胡须鸡(♂为3只，♀为3小组，S/P值分别在0.2～1、1～2、>2，每组8只)；(3)对照组，阴性芦花公鸡♂×阴性汶上芦花鸡♀(8只)，具体见表1。实验鸡群人工输精，每个母鸡个体单独一个输精枪头，收集种蛋12 d。种蛋标记，孵化盒分装孵化，雏鸡隔离饲养。

1.2 样品采集与处理

43周龄采集惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡无菌抗凝血1.5 mL，并同时采集精液。对试验组后代采集1日龄胎粪，42日龄泄殖腔拭子、无菌抗凝血血液，死亡实验鸡群的肝组织。胎粪和泄殖腔拭子：检测前反复冻融3次，静置取上清。血液、精液和肝组织处理及其病毒分离见参考文献[14，18-19]。

表1实验公母鸡分组情况

Table1Groupingsituationofroostersandhens

组别Groups公鸡RoostersS/P值S/P value母鸡HensS/P值S/P value阳性♂×阴性♀A阳性惠阳胡须鸡0.877×阴性芦花鸡8只—B阳性惠阳胡须鸡1.856×阴性芦花鸡8只—C阳性惠阳胡须鸡4.328×阴性芦花鸡8只—阴性♂×阳性♀D阴性芦花鸡—×阳性惠阳胡须鸡8只0.2～1E阴性芦花鸡—×阳性惠阳胡须鸡8只1～2F阴性芦花鸡—×阳性惠阳胡须鸡8只>2阴性♂×阴性♀G阴性芦花鸡—×阴性芦花鸡8只—

1.3 p27抗原ELISA检测

血浆病毒分离细胞上清，“1.2”中收取的毒液，冻融后的胎粪与泄殖腔拭子上清，用ALV p27抗原试剂盒检测，具体操作按照IDEXX公司ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 前病毒cDNA的制备

根据病毒分离ELISA检测结果，收取阳性的DF-1细胞沉淀，按 OMEGA 公司 SQTISSUE组织 DNA 试剂盒说明书制备前病毒基因组cDNA，-20 ℃ 保存备用。

1.5 分离株env基因的PCR扩增和序列分析

针对env基因设计并合成一对通用引物，用于扩增ALV囊膜蛋白env基因约2.6 kb片段(上游引物5′-CGAGAGTGGCTCGCGAGATGG-3′；下游引物5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′)。以前病毒基因cDNA为模板，PCR扩增ALV囊膜蛋白env基因，片段大小约2.6 kb。阴性对照为DF-1细胞DNA，阳性对照为ALV-J NX0101株。反应条件：96 ℃预变性7 min；95 ℃变性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32个循环，72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用TaKaRa公司DL5000 Marker，产物回收、纯化后扩增克隆至pMD18-T载体中测序。

1.6 数据统计与分析

采用SPSS16.0t检验对p27抗原阳性率进行比较分析，采用Blast和MEGA4.0程序进行序列比对和聚类分析。

2 结 果

2.1 阳性公、母鸡后代ALV检测结果

后代ALV检测结果(表2)表明，阳性公鸡后代的胎粪p27抗原阳性率为23.49%，42日龄泄殖腔拭子p27抗原阳性率为36.60%，42日龄病毒分离阳性率为8.54%；阳性母鸡后代的胎粪p27抗原阳性率为12.42%，42日龄泄殖腔拭子p27抗原阳性率为19.89%，42日龄病毒分离阳性率为0%；阳性公鸡后代的胎粪、泄殖腔拭子和病毒分离阳性率显着高于阳性母鸡后代。

2.2 病毒分离检测阳性鸡S/P值高低与后代ALV检测阳性率的相关性

病毒分离检测S/P值高低与后代ALV检测阳性率的相关性分析结果(表3)表明，输精个体S/P值的高低与后代阳性率无相关性(P>0.05)。

2.3 胎粪、泄殖腔拭子与病毒分离p27抗原检测阳性率比较

对胎粪、泄殖腔拭子与病毒分离p27抗原检测阳性率进行比较，发现当公鸡为阳性时，在后代胎粪检测为阴性群体中，病毒分离检测却检测到3个阳性个体，胎粪检测阳性个体与病毒分离检测阳性个体的符合率为85%。说明胎粪检测有一定的漏检率。42日龄棉拭子检测的阳性个体与病毒分离阳性个体的阳性符合率为100%。

2.4 病毒分离阳性个体env基因的PCR扩增和测序

ALVenv基因PCR扩增产物大小在2 600 bp左右，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.5 分离株env基因核苷酸序列分析

利用Blast对分离株env的gp85基因序列与GenBank数据库比对，结果表明，测序序列与已报道的ALV-J亚型序列(登录号AF247385.1、KF796647.1、KT598484.1、GU222401.1、KT598483.1、JX855935.1)相似性>95%。该分离株的gp85序列与A、B、J亚型参考株的gp85基因序列进行遗传演化分析，如图2中显示，该序列与J亚型聚在同一分支，进一步证明该毒株为J亚型。

表2阳性公、母鸡后代p27抗原检测

Table2p27antigendetectionresultofALV-positiveroostersandhens

指标 Index阳性公鸡后代Offsprings of ALV-positive roosters阳性母鸡后代Offsprings of ALV-positive hens组别Group阳性率/% Positive rate组别Groups阳性率/%Positive rate胎粪p27抗原A22.50(18/80)D12.50(8/64)p27 antigen from meconiumB21.05(16/76)E12.70(8/63)C26.92(21/78)F12.07(7/58)x23.49±0.03*x12.42±0.00泄殖腔拭子p27抗原A36.36(28/77)D19.05(12/63)p27 antigen from cloacal swabsB34.25(25/73)E20.97(13/62)C39.19(29/74)F19.64(11/56)x36.60±0.01*x19.89±0.01病毒分离p27抗原A8.75(7/80)D0(0/63)p27 antigen from plasmaB7.89(6/76)E0(0/63)C8.97(7/78)F0(0/58)x8.54±0.01*x0

阳性公鸡后代与阳性母鸡后代相比，*.P<0.05(t检验)

Compared with offsprings of ALV-positive hens, *.P<0.05 (ttest)

表3阳性公、母鸡43周龄病毒分离S/P值与其后代ALV阳性率的相关性分析

Table3CorrelationanalysisofamountofALVcarriedorshedbyALV-positiveroostersandhensandpositiverateofp27antigenintheiroffsprings

动物及相关性分析Animal and correlation analysisS/P值S/P value胎粪p27抗原阳性率/%Positive rate of p27 antigen from meconium泄殖腔拭子p27抗原阳性率/%Positive rate of p27 antigen from cloacal swabs病毒分离p27抗原阳性率/%Positive rate of p27 antigen from plasm阳性公鸡0.87722.50(18/80)36.36(28/77)8.75(7/80)Positive roosters1.85621.05(16/76)34.25(25/73)7.89(6/76)4.32826.92(21/78)39.19(29/74)8.97(7/78)相关性分析 Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05阳性母鸡0.2～112.50(8/64)19.05(12/63)0(0/63)Positive hen1～212.70(8/63)20.97(13/62)0(0/63)>212.07(7/58)19.64(11/56)0(0/58)相关性分析Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05

3 讨 论

3.1 试验组个体与检测时间点的选择

本试验开展的前提基础是能准确筛选出阳性鸡个体和阴性鸡个体。根据发病鸡的表型和实验室检测可准确检测出禽白血病阳性个体，但是阴性个体确定十分困难。为确保试验的准确性，惠阳胡须鸡阳性个体确定是通过43周龄血液病毒分离检测阳性结果，结合试验后期病症解剖观测；汶上芦花鸡阴性个体是通过43周龄血液病毒阴性结果，结合家系病史追溯，要求筛选出的阴性个体上3个世代家系内没有出现禽白血病个体。

在前期工作中对地方鸡种进行了排毒规律摸索，发现5周龄排毒量最高[18]，结合生产的需要(6周龄进行筛选鸡群进行转群)，试验确定在6周龄对试验组后代个体进行禽白血病病毒分离检测。通过PCR扩增测序和遗传聚类分析，确定本试验个体感染毒株为J亚型禽白血病病毒。

3.2 ALV通过阳性公鸡(母鸡)传播后代的规律

赵鹏等[20]研究发现种蛋中禽白血病病毒p27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率呈正相关。本试验结果进一步验证了ALV可通过公鸡精液传播给后代，且公鸡在ALV传播给后代过程中起重要作用。

M. DL5000相对分子质量标准；1～5. ALV env基因扩增产物M. DL5000 marker；1-5. Amplification products of ALV env图1 ALV env基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of ALV env

△.本研究分离毒株序列；○.ALV-B gp85基因序列；□.ALV-A gp85基因序列△.Sequence of isolated strain in this study；○.gp85 gene sequence of ALV-B；□. gp85 gene sequence of ALV-A图2 不同亚型禽白血病毒株gp85基因序列的遗传演化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of gp85 gene sequence of avian leukosis viruses strains subtype A，B and J

试验发现禽白血病阳性公鸡后代病毒分离的阳性率为8.54%，禽白血病阳性母鸡后代没有发现阳性个体；且阳性公鸡后代的胎粪p27抗原、泄殖腔拭子p27抗原与血液病毒分离阳性率显着高于阳性母鸡后代。该研究结果进一步验证了张培培等[13，17]的研究结果，更进一步得出了阳性公鸡对ALV的垂直传播影响较大的结论。对于在阳性母鸡后代中没有发现阳性个体，分析主要有几方面原因：一是品种原因，不同品种对ALV的易感性不同；且本试验是杂交试验，有可能增强了鸡的抵抗力；二是本试验并非SPF鸡，鸡本身存在抗体；三是采取了母鸡单个输精枪头；四是可能与检测的时间点有关；课题组对试验鸡群将继续饲养检测进行进一步验证。

试验结果提示在禽白血病净化过程中，应加大对公鸡的检测力度，建议采取血液病毒分离和精液病毒分离相结合的方法[17]。

3.3 阳性鸡S/P值大小对后代阳性率影响

本试验禽白血病检测使用的ELISA试剂盒，其阳性判定标准为S/P>0.2。S/P值高低与后代阳性率是否存现相关性，相关报道较少。郝建勇等[15]研究表明，在蛋清ELISA检测时，S/P值高低与对应母鸡外源性ALV病毒血症有一定的相关性。本试验结果发现43周龄血液病毒分离检测为阳性个体的S/P值高低与后代的阳性率没有显着的相关性。

3.4 不同检测方法阳性率比较

针对胎粪、泄殖腔拭子的假阳性和漏检等研究报道很多，陈俊霞等[21]研究发现，胎粪p27抗原检测和泄殖腔拭子p27抗原检测均有较高的假阳性，并且有一定的漏检。俞燕等[18]也发现泄殖腔拭子有较高的假阳性，且有漏检。

本试验发现，胎粪p27抗原与泄殖腔棉拭子p27抗原检测存在较高的假阳性，尤其是泄殖腔棉拭子p27抗原检测假阳性较高。在胎粪p27抗原检测阴性个体中，血液病毒分离p27抗原检测出现了3个阳性个体，胎粪检测漏检率为15%。42日龄泄殖腔拭子p27抗原检测结果与病毒分离检测符合率为100%。对禽白血病进行净化，一般情况下，前期检测(胎粪、42日龄血液病毒分离)采取的是家系淘汰法，即一个个体为阳性，家系后代全部淘汰，增加了净化工作量和成本。因此建议不进行胎粪及泄殖腔拭子ALV检测。

在AL的防控中，除了对种群进行ALV检测及时淘汰阳性个体，还应制定严格的饲养管理措施。孵化、育雏、疫苗免疫、输精等是影响禽白血病水平传播的重要途径，生产中对新疫苗及时进行禽白血病检测，疫苗注射在不同品种间换针头，多品种一起继代繁殖时，每个品种(家系)使用固定的输精杯，阳性率高、低品种分开孵化出雏。

4 结 论

在地方品种惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡中，ALV阳性公鸡后代的阳性率显着高于阳性母鸡后代，血液病毒分离检测阳性鸡S/P值高低与后代阳性率没有显着相关性，ALV胎粪检测和泄殖腔棉拭子具有较高的假阳性率。研究结果为进一步制定更合理的禽白血病净化方案提供了理论依据。