吴家媛，马欣荣，唐 琳，张绍伟，管晓燕，洪献忠，吴志刚，张 剑，梁文红，刘建国

(1.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义563003；2.中国科学院成都分院生物研究所，四川成都610041)

随着分子生物学技术的飞速发展,通过基因工程改造的转基因植物已成为一种新型的生物反应器,细菌或病毒等病原体的抗原基因可在转基因植物表达系统中表达，且表达的抗原仍较好地保留了天然的免疫原性[1]。龋病是多因素共同作用的结果,其中变异链球菌在牙面的粘附和聚集是龋病发生的首要条件，其表面蛋白抗原PAc被认为是变异链球菌的主要毒力因子之一，A区为其氨基端富含丙氨酸的重复序列，是表面蛋白抗原发挥粘附功能重要功能区，含有B细胞和T细胞的抗原表位，不仅与粘附表位重叠而且是重要的免疫活性区[2]。本研究用已在大肠杆菌中正确表达的变异链球菌表面蛋白的A区和霍乱毒素B亚单位的融合基因作为目的基因，经中间载体介导与植物表达载体相连，构建高效植物表达载体，以期增强转基因植物中抗原蛋白的免疫应答反应。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒 大肠杆菌菌株JM109，根癌农杆菌菌株EHA105；质粒pCAMBIA2301；中间载体pBPC55（北京市农林科学院张晓东博士馈赠）；质粒pEAC10：含有变异链球菌表面球蛋白（PAc）A区与霍乱毒素亚单位(CTB)的嵌合基因pacA/ctxB（遵义医学院龋病研究室提供）。

1.1.2 试剂 卡那霉素，利福平由荷兰Duchefa公司生产；限制性核酸内切酶，T4连接酶，胶回收试剂盒，Taq DNA聚合酶及碱性磷酸化酶CIP等购自大连宝生物公司。其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 表达载体质粒p2355的构建

1.2.1.1 目的片段的获取 中间载体p BPC55和植物双元表达载体 pCAMBIA2301分别以 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳回收约1.1kb的片断。

1.2.1.2 连接及连接产物的转化[3]按1：4的摩尔比混合连接载体pCAMBIA2301和pBPC55的酶切产物回收片断，于16℃反应16h。取5L连接产物转化JM 109，100 mg/L卡那霉素平板蓝白斑筛选。挑取白色菌落，碱法抽提重组载体质粒p2355，酶切鉴定。

1.2.2 携带目的基因的植物表达载体p2355-PAcA/CTB的构建

1.2.2.1 目的基因的克隆 依 据重组质粒pEAC10的测序结果设计PCR引物，上游：5'>T GAT TCT AGA ATG GAT GAA ACG ACC ACT ACT AG<3'，下游：5'>A TCG GGT ACC TTA ATT TGC CAT ACT AAT TGC<3'，由成都法玛基因生物公司合成。

PCR反应条件为：95℃变性2min后95℃30s，54℃45s，72℃1.5min ， 循环30次，72℃延伸10min。PCR反应体系为：质粒pEAC10 1L，10×PCR 反应缓冲液5L，Taq聚合酶0.4L,dNTP 5L，加双蒸水至总体积为50L。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化,产物克隆到pMD18-T载体,经氨苄青霉素及蓝白斑筛选,挑取白色菌落碱法抽提质粒，XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定。

1.2.2.2 连接及连接产物的转化将回收片段与经XbaⅠ和KpnⅠ双酶切消化后的重组载体p2355按4：1的摩尔比混合,16℃,16h进行连接反应。取5L连接产物转化JM109，涂布于含100mg/L卡那霉素LB固体平板。

1.2.2.3 植物表达载体的鉴定 挑选阳性转化子，碱法提取质粒，酶切验证重组子。植物表达载体p2355-PAc A/CTB、pBPC55及 p2355分别用 XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定。

1.2.2.4 植物表达载体的农杆菌转化与PCR鉴定将构建的表达载体 p 2355-PAcA/CTB用电转化法转化根癌农杆菌株系EHA105，28℃培养2d后长出菌落。挑取单菌落于含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(50mg/L)的LB液体培养基中28℃培养2d，碱法提取质粒，用PCR方法检测，引物与反应条件同

1.2.2.1 ,DNA模板为p2355-PAcA/CTB。1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1重组质粒p2355的构建 结果如图1所示，重组质粒和 pBPC55用 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切能切下包括CaMV35S启动子、Nos终止子和MCS的1.1kb的DNA片段，而对应的pCAMBIA301没有。pCAMBIA2301用 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后切除了50bp大小的多克隆位点（电泳不易观察）得到线性化的pCAMBIA2301载体。第3,7泳道的1.1kb左右的片段，正是质粒pBPC55的35S启动子加上多克隆位点及 Nos终止子的大小，表明重组质粒p2355构建成功。

2.2 携目的基因的植物表达载体p2355-PAc A/CTB的构建与鉴定 结果如图2所示，目的基因经PCR后的产物直接克隆到pMD18-T载体，挑选阳性转化子抽提质粒，用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切,分别得到相应的2.6kb载体片段和约1.7kb目的基因片段,将该目的基因连接到重组质粒 p2355中35S启动子下游，构建植物表达载体p2355-PAc A/CTB。植物表达载体p2355-PAc A/CTB的XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定证明目的基因已整合到载体p2355中。

2.3 植物表达载体p2355-PAcA/CTB的农杆菌转化与PCR鉴定 将p2355-PAcA/CTB质粒以电转化的方法转化农杆菌的EHA105菌株,获得了大量转化子。提取质粒并进行PCR检测,以1.2.2.1中引物扩增出与阳性对照相同大小为1.7kb的目的基因特异性条带(图3),说明重组质粒已经导入农杆菌中。

图1 质粒p2355电泳验证图

图2 质粒p2355-PAc A/CTB酶切产物琼脂糖电泳图

图3 表达载体的PCR鉴定

3 讨论

从1990年Curtiss等首次提出了用转基因植物表达系统生产可食疫苗以来，基因工程技术的日趋普及和植物转基因技术的飞速发展，使植物作为生物反应器规模化生产疫苗成为可能，并正在成为有重要经济价值的异源蛋白表达体系。利用可直接生食的植物是生产口服疫苗的必然趋势,可直接口服免疫，使用方便，易于生产、运输和储存，故便于推广和普及[4~6]。

外源基因在植物的表达中启动子的作用非常重要，它决定了基因转录的效率和基因表达的特异性。CaMV35S启动子是一种组成型启动子，含有一个双增强子序列，能使嵌和的外源基因在植物细胞中表达，且表现出强烈的表达功能[7]。p CAMBIA载体系列是澳大利亚CAMBIA在1997年开发的迄今为止转化效率最高的植物遗传转化载体系统之一，可在大肠杆菌中复制。因此本研究在pCAMBIA2301的多克隆位点中插入由中间载体质粒pBPC55的CaMV35S启动子、启动子下游需要表达的目的基因和NOS终止子，以期在转基因植物中获得高效表达。所构建的载体含有供植物选择的卡那霉素抗性基因以及报告基因Gus，便于表达的检测。

重组质粒pEAC10含有PAc的完整A区基因序列和CTB基因的全序列，长1734bp,因无合适的酶切位点,我们设计了一对引物,以pEAC10为模板，PCR方法扩增出两端含XbaI和KpnI两个酶切位点的目的基因pacA-ctxB，以便定向克隆至表达载体上。PCR产物在琼脂糖凝胶上仅见一条DNA扩增带,大小为1.7kb,与我们设计一致。

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