rhEGF凝胶对兔皮肤Ⅲ度烧伤创面TNF-α水平的影响

惠学玲，冯国纹，余丽梅，王钰莹，杨进，赵春华

(1.遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州遵义 563099；2.中国医学科学院组织工程中心，北京 100005)

·基础医学研究·

惠学玲1，冯国纹1，余丽梅1，王钰莹1，杨进1，赵春华2

(1.遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州遵义 563099；2.中国医学科学院组织工程中心，北京 100005)

目的观察重组人表皮生长因子(rhEGF)凝胶治疗兔皮肤Ⅲ度烧伤的作用及创面组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的变化。方法铜棒烫伤致兔腹背部皮肤Ⅲ度烧伤，切痂后治疗侧用rhEGF凝胶涂抹创面，自身对照侧涂等体积生理盐水，肉眼观察两侧创面修复情况，并测量未愈合创面面积，HE染色后进行病理组织学检查，ELISA法检测组织TNF-α水平。结果治疗第3、18天，rhEGF治疗侧创面愈合率显着高于对照侧(P<0.05)；治疗第3天，rhEGF治疗侧创面组织红肿明显较对照侧轻。病理学检查显示，rhEGF侧组织红肿明显较对照侧轻，炎细胞浸润也较少，且创面组织中TNF-α含量明显低于对照侧(P<0.01)。结论rhEGF凝胶可明显促进兔皮肤Ⅲ度烧伤修复，与其在炎症期降低创面组织TNF-α水平，减轻炎症反应有关。

重组人表皮生长因子凝胶；Ⅲ度烧伤；肿瘤坏死因子-α

皮肤移植是较大面积Ⅲ度烧伤最重要的治疗手段，目前常用的皮片包括自体皮肤、猪皮、人工皮肤等；此外，重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)与人羊膜等生物材料也开始用于临床[1-3]。研究表明，烧伤炎症期，IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-10、INF-γ等多种炎症与抗炎因子，参与炎症反应的过程；表皮生长因子、VEGF等因子则促进细胞增殖，在修复期参与新生组织的形成与创面愈合[4-5]。rhEGF是采用基因工程技术生产的一种可以促进表皮细胞增殖、分化的多肽类生长因子，可明显促进难愈合创面和深Ⅱ度烧伤的创面愈合[6]。临床上rhEGF凝胶涂抹于难愈性创面和Ⅱ度烧伤均取得了较好的治疗效果[7-8]。本实验将rhEGF凝胶用于兔皮肤Ⅲ度烧伤，主要观察其对炎症期创面炎症反应及创面组织TNF-α水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康新西兰大白兔由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(渝)2012-0006，体重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清洁级动物室适应性饲养1周，术前24 h禁食不禁水。

1.2 主要试剂与仪器硫化钠(由上海化学试剂总厂生产，批号20090306)，戊巴比妥钠(由北京化学试剂公司生产，批号060222)，rhEGF凝胶(由桂林华诺威基因药业有限公司生产，批号S20020112)，密闭，4～25 ℃保存， BCA蛋白浓度测定试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所(批号P0010S-1)，TNF-αELISA检测试剂盒购于上海雅吉生物科技有限公司(批号201210)，自制铜棒直径4 cm。

1.3 Ⅲ度烧伤模型制备 15只兔备皮后，用6%硫化钠局部涂抹脱毛，3%戊巴比妥钠1.0 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，用铜棒直接贴于兔腹背部两侧对称的皮肤，180 ℃烫8 s，皮肤呈蜡白色，病理证实烫伤深达皮下组织，确认为Ⅲ度烧伤创面。

1.4 实验分组与处理兔烧伤48 h后切痂，用透明方格纸测量切痂后的创面面积，采用photoshop软件计算烫伤面积。兔左侧创面涂抹约2.5 g rhEGF凝胶一层，为rhEGF侧，右侧为对照侧，涂抹等体积生理盐水，两侧各敷一层油纱后加压包扎。

1.5 创面愈合率治疗后第3、18天，分别测量其未愈合的创面面积，计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.6 组织病理学检查肉眼观察创面红肿、炎症反应状态及愈合的一般情况，治疗后第3、18天各处死5只动物，取创面新生组织，固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.7 ELISA法检测TNF-α 治疗后第3天处死动物后立即从创面中央取新生组织0.1g，分别将组织剪碎，置于匀浆器中，加入预冷的PBS 1 mL，冰浴上研磨10 min，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白浓度测定，将上清液中的总蛋白浓度定量在1 mg/mL,然后按兔TNF-αELISA试剂盒操作说明，450 nm条件下，测定吸光度值，绘制标准曲线，通过线性方程计算均浆液中TNF-α含量(pg/mL)。

2 结果

2.1 创面愈合率治疗第3、18天，rhEGF侧愈合率均明显高于对照侧(P<0.05)(见表1)。

组别第3天第18天 rhEGF侧23.72±3.97*93.33±2.08* 对照侧17.62±3.7189.64±1.61

注：*P<0.05与对照侧比较。

2.2 组织病理学检查烫伤后48 h，创面形成，切取焦痂下创面组织，HE染色，显微镜下观察，未见皮肤全层结构，仅见组织凝固性坏死(图2A)，确认Ⅲ度烧伤模型建立成功；rhEGF凝胶治疗第3天，肉眼可见，对照侧创面存在较为明显的红肿，而rhEGF侧创面红肿明显减轻(见图1A、B)。高倍镜下观察，双侧创面组织均未见皮肤的组织结构，对照侧可见皮下组织水肿明显，并有较多炎性细胞浸润(见图2B)，而rhEGF侧皮下组织水肿明显减轻，炎性细胞也较少(见图2C)。第18天，双侧创面明显缩小，以rhEGF侧更为明显，均未见明显红肿(见图1C、D)，镜下观察已可见较完整的皮肤组织结构及新生的肉芽组织。

2.3 创面组织TNF-α水平烧伤创面自然过程中，1周内主要为炎症期，之后才进入修复期。为此治疗后第3天，检查结果显示rhEG侧创面组织中TNF-α水平明显低于对照侧(P<0.01)(见表2)。

组别第3天rhEG侧1597.06±35.70**对照侧1781.76±89.24

注：**P<0.01与对照侧比较。

注：A、B为第3天，C、D为第18天，A、C为rhEGF凝胶侧，B、D为对照侧。图1 rhEGF凝胶对兔Ⅲ烧伤创面愈合的影响

注：A为模型，B为对照侧，C为rhEGF侧。图2 rhEGF凝胶治疗第3天创面组织病理学检查(HE A: ×40，B、C：×400)

3 讨论

表皮生长因子是广泛存在于生物体内的活性蛋白质，表皮生长因子及其受体存在于除造血系统以外的所有组织中，它的生理功能非常广泛，可影响表皮细胞或成纤维细胞等的细胞周期转换，加速细胞的分裂增殖，促进组织修复细胞内DNA与RNA以及蛋白质的合成，表皮生长因子为创面肉芽组织形成及参与创面修复所需要的一种细胞因子[9-10]。rhEGF在分子结构、生物学活性及生理功能上与人内源性表皮生长因子高度一致[11]。研究表明rhEGF对深Ⅱ度烧伤创面有促进愈合，减少瘢痕增生的作用。作为外源性生长因子，rhEGF凝胶能促进皮肤创面组织修复过程的DNA、RNA 和羟脯氨酸的合成，进而加快创面肉芽组织的行成以及上皮细胞的增殖，从而使创面愈合时间缩短，其机制与rhEGF凝胶使创面局部形成一个湿润的、适宜组织修复的环境，促进坏死组织脱落和肉芽组织生长有关[7]。

本实验将rhEGF凝胶用于Ⅲ度烧伤模型，治疗第3天，rhEGF侧愈合率高于对照侧，肉眼也观察到对照侧创面明显红肿，而rhEGF侧创面的红肿明显减轻，且高倍镜下可见对照侧皮下组织水肿明显，并有较多炎性细胞浸润，而rhEGF侧皮下组织水肿明显减轻，炎性细胞也相对较少，表明rhEGF凝胶具有明显的创面保护作用，在炎症期即可减轻炎症反应，也可一定程度地促进创面修复。治疗第18天，rhEGF侧的愈合率以接近95%的愈合标准，显着高于的对照侧，表明rhEGF凝胶在Ⅲ度烧伤创面修复期中发挥了重要作用，从而明显促进创面修复，缩短愈合时间，疗效明显优于单独的创面油纱覆盖、包扎。TNF-α是由炎细胞产生的重要炎症因子，可同其它炎症因子一起介导烧伤创面的炎症反应，损伤组织[12-13]。检测创面组织中TNF-α含量，也发现rhEGF侧TNF-α水平明显低于对照侧，表明rhEGF凝胶所发挥的抗炎作用，与降低局部组织TNF-α水平有关，也可能与rhEGF凝胶的创面湿润、创面保护，间接减轻炎症反应和降低炎症因子水平。总之，rhEGF凝胶可促进兔皮肤Ⅲ度烧伤的愈合，其作用机制与炎症期降低创面TNF-α水平，从而减轻炎症损伤有关。

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[收稿2012-10-14;修回2013-02-17]

(编辑：谭秀荣)

EffectsoftherecombinanthumanepidermalgrowthfactorgelonTNF-αlevelofrabbitswithskinthirddegreeburn

Huixueling1，Fengguowen1，Yulimei1，Wangyuying1，Yangjin1，Zhaochunhua2

(1.Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical Universty,Guizhou Zunyi 563099,China; 2.Tissue Engineering Center, Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100005,China)

ObjectiveTo observe the effects of the recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) gel on skin third degree burn in rabbits and the level of tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the wound tissue.MethodsThe skin third degree burn of front and rear part in the New Zealand rabbits was made by ambustion of copper bar. The rhEGF gel was smeared on the wound of the treatment side after surgical removal of the scar and equal-volume of physiological saline was smeared on the control side. The process of wound restoration was observed and unhealthy wound area was measured. HE Staining of wound tissue was performed for histological examination. TNF-α level was detected using enzyme-1inked immunosorbent assay.ResultsThe wound healing rate of rhEGF treatment side was notably higher than that in the control side in the third and 18th days after treatment (P<0.05). In the third day after treatment,red swelling in the rhEGF treatment side was markedly slighter than that is the that in the control side.histological examination showed that the milder edema, less inflammatory cells and lower content of TNF-α in rhEGF treatment side were detected than those in the control side.ConclusionrhEGF gel could promote the repair of skin third degree burn in rabbits and this effect might be associated with the decreased TNF-α level of wound tissue and the reduced inflammatory reaction in inflammation phase.

the recombinant human epidermal growth factor gel; third degree burn; tumor necrosis factor-α

R644

1000-2715(2013)02-0101-04

贵州省科技厅平台建设资助项目(NO:209.001.106.01)。

赵春华，男，博士，教授，研究方向：干细胞基础与临床，E-mail:chunhuaz@public.tpt.tj.cn。