高明娟(综述)，刘远梅(审校)
(遵义医学院附属医院小儿普胸泌外科，贵州遵义 563099)
先天性巨结肠(Hirschsprung＇s disease，HD)是小儿常见疾病，发病率高达1/2000－1/5000，最显着病理生理变化是病变肠管神经发育异常或确缺如，导致局部肠管痉挛和狭窄，肠蠕动丧失和内括约肌松弛反射消失，随着近端肠管的蠕动，不断推挤肠内容物向前，引起狭窄段近端肠管扩大，从而形成继发性巨结肠，是严重影响儿童健康的先天性疾病。目前，HD保守治疗效果差，多数需手术治疗，但各种手术并不能从根本上恢复所有肠道功能，均有相应缺陷和并发症［1］，许多患儿术后肠道运动功能紊乱持续存在［2－3］，术后并发症高达20% ～30%。
1 先天性巨结肠的发病机理及肠神经嵴干细胞移植治疗的理论基础
肠道的运动由肠神经系统(enteric nervous system，ENS)控制，其解剖基础是肠道壁内具有神经元的神经丛。ENS的所有神经元和神经胶质细胞均起源于神经嵴干细胞，各种原因引起的神经干细胞迁移和分化异常，均会造成肠神经元解剖和功能异常，最终可导致HD。目前HD的病因尚未完全阐明，近年来在分子遗传学领域取得了突破性进展，已经发现9个基因、4个区域与HD的发病有关联，编码酪氨酸激酶通路的基因(包括RET原癌基因，GDNF基因，GFRa－I基因等)，编码血管内皮素信号通路的基因(包括EDNRB基因，EDN3基因和ECE－I基因)，编码转录因子的基因(如 SOXl0基因和PHOX2B基因)，这些基因和区域的作用均围绕RET信号通路和内皮素信号通路展开，参与信号通路网络组成或修饰核心基因，它们的异常将引起信号转导的异常，影响神经干细胞(neural crest stem cells，NCSC)的分化、增殖及移行。Iwashita等［4］发现4种高表达于NCSC的基因(RET、SOxl0、GFRal和EDNRB)发生缺失时，肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells，GNCSCs)明显减少，并导致受累肠道的相应神经节发生了缺失，因此推测HD可能是一种神经干细胞疾病。由此设想，能否通过移植GNCSCs至神经元发育缺陷肠段，并使其在肠壁内迁移、分化、增殖，恢复病变肠管神经系统的结构和功能，从而达到治疗HD的目的。
2 GNCSCs的特点及影响其增殖、迁移的因素
肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells，GNCSCs)起源于胚胎期的神经管背侧，部分NCSCs定向分化为肠神经系统(ENS)的神经元和神经胶质细胞，被称为肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，其与CNS－NSCs比较，有相当不同的潜力，更可能对肠管特异性的环境起反应，更接近于正常肠神经系统生物学特性，而利用肠道神经嵴干细胞未分化的特性来弥补肠道神经节细胞的缺失，可能更适合于HD 的治疗目的［5］，GNCSCs存在于肠道组织中，具有自我更新和分化能力，是未分化细胞分布于特定的已分化组织中，数量很少，在一定程度上维持细胞功能的稳定状态，肠神经嵴细胞具有干细胞的特点，有自我更新的能力，能够分化形成来自两个胚层的多种细胞，GNCSCs主要来源于神经嵴的2个部位，分别是迷走神经嵴和骶神经嵴，来源于迷走神经嵴的GNCSCs首先进入前肠间质，然后沿头端向尾端方向迁移，最终定植于整个肠道［6］。
在GNCSCs的增殖、迁移过程中，GNCSCs自身的转录因子、受体与小生境所含的各种生长因子、细胞外基质蛋白相互作用，从而保证细胞的存活、促进细胞增殖、诱导细胞迁徙至指定位置并定植、分化为特定的神经元和神经胶质细胞［7］。有研究发现，当胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)与受体RET结合即可激活GNCSCs存活的信号通路，而GDNF缺失就会诱导细胞凋亡［8］。GNCSCs总是朝着肠管中未结合状态的GDNF方向移动，因此不同部位GDNF的浓度差是影响GNCSCs迁徙的重要因素。内皮素3(EDN3)和其受体内皮素受体B(EDNRB)也是GNCSCs发育中另一重要的配体受体信号通路，EDNRB及其配体EDN3基因突变会导致GNCSCs迁徙、定植失败，证实该通路对GNCSCs具有促进增殖和抑制分化的作用［9］。SOX10表达于迁徙至胚肠间质之前及其过程中的GNCSCs上，对GNCSCs的生存起着重要意义，Bondurand［10］发现，SOXl0可通过调节EDNRB的表达影响GNCSCs发育，维持GNCSCs的干细胞特性，抑制其向神经元和神经胶质细胞分化。神经干细胞迁徙的启动需要骨形态发生蛋白(BMP)的参与，其迁徙受BMP－4及其拮抗蛋白 Noggin的影响［11］。BMPs对GNCSCs的促分化作用主要是通过调节神经营养因子3(neurotrophin 3，NT－3)的TrKC受体表达实现的，而NT－3可以直接或与GDNF、睫状营养因子(ciliary neurotmphic factor，CNTF)联合影响GNCSCs的分化和晚期肠神经元的发育［12］，所以，GDNF、EDN3、SOX10、BMP 等是影响 GNCSCs增殖、迁移的主要因素。
3 肠神经嵴干细胞移植治疗先天性巨结肠的现状
目前利用干细胞的多潜能性，恢复宿主的中枢及周围神经系统的正常结构和功能，目前应用最多的是胎脑组织移植治疗帕金森病，然而，在临床上要获得更多的脑组织有很大困难，除了来源困难外，还有伦理上的束缚。因此，如果能用外周组织中提取出来的神经干细胞，在体外扩增后建立神经干细胞株，再次移植至目标病变区域，将使干细胞移植变得简单而有效。有研究表明可通过基因操作，筛选出单克隆神经干细胞，如 Wangs［13］等将一种绿色荧光蛋白的基因转导于细胞中，而该基因的启动子为神经元Ta蛋白，则该细胞可获得绿色荧光蛋白的表达，通过荧光分析识别并分离出神经干细胞，使目的干细胞得到纯化。干细胞可以在分化前的培养过程中无限增殖，一些研究发现，把从胚胎神经组织中分离获得的神经干细胞注入损伤模型动物大脑，神经干细胞可迁移至损伤部位，并分化成所需要的细胞种类。Micci等［14－15］研究证明小鼠神经干细胞移植到同类动物胃幽门部可以存活，并且可以检测到神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞，进一步研究发现移植的神经干细胞可以从功能上改善胃轻瘫小鼠模型的胃排空能力。
肠神经干细胞为更加特异分化的单能干细胞，有人亦称之为肠神经系统的祖细胞，理论上是治疗肠神经元发育缺陷症或损伤性疾病更为适合的神经干细胞。一直以来，干细胞移植治疗HD的研究主要集中在胚胎干细胞、中枢神经系统干细胞、骨髓间充质干细胞，而GNCNCs相对上述干细胞而言，迁移能力更强，属于肠神经系统的定向前体细胞，易对肠道特异性小生境产生反应，更能向所需要的肠道功能细胞发育。目前脑神经干细胞的提取和培养已是一种成熟的研究方法，但肠神经干细胞存在于肠管中，含量较少，有其他组织细胞混杂，提取困难，技术要求高，提取方法和条件独特，不同于脑神经干细胞，国内外报道肠神经嵴干细胞提取、培养的文献亦较少［16－19］。Almond 等［20－21］报道，从人胚胎及婴儿(生后5个月)肠管分离出GNCSCs，体外扩增培养后移植至无神经节细胞的肠管中，该细胞可存活并分化为神经元和神经胶质细胞，移植后可获得一部分肠管功能恢复［22］。王岗、肖莉等［23－24］已经成功建立了分离培养纯化及鉴定肠神经嵴干细胞的方法，并将其成功地移植入动物模型。近期，Metzger等［25］从80岁老人肠管分离和体外培养了肠祖细胞，并分化为具有ENS特征的神经元及其亚型和神经胶质细胞，成体肠管分离、体外培养肠祖细胞的成功使我们更加确信GNCSCs存在于生后肠管且在一定条件下能进一步分化为ENS神经元及其亚型，为干细胞移植治疗HD带来希望。张建军等［26］实验证实在HD患儿肠黏膜层存在ENS干细胞，可以从HD患儿有神经节段肠管的肠黏膜活检标本中分离、体外培养ENS于细胞，这不仅增加了干细胞移植的来源，还可以对HD患儿行自体干细胞移植，同时解决了干细胞移植的伦理学问题、移植后的免疫排斥反应等。上述实验表明，将GNCSCs在体外大量扩增后移植至神经节细胞缺失肠段，使其迁移至病变肠段并分化成所需要的细胞种类，以达到治疗先天性巨结肠的目的，具有现实意义及可行性。
4 展望
肠神经嵴干细胞移植治疗先天性巨结肠虽还处于一些实验研究和移植尝试阶段，但已有研究证实其移植的可行性。然而，在进行临床应用前，尚有许多问题需要解决，目前仍需应用生物化学和基因技术来了解GNCSCs是如何发挥作用的，怎样使正常的肠神经系统发挥功能，GNCSCs移植后新生神经元与周围组织的整合、神经元轴突定向生长、与靶细胞之间的突触形成等问题，还需了解移植后干细胞存活时间及移植后排斥问题等。而成体肠管组织中肠神经嵴干细胞数量极少，且肠道中细菌多，原代培养时单细胞悬液的制作过程中，如何解决污染的问题并有效提取出肠神经嵴干细胞，也是需解决的难题。在医疗安全日益受到关注的今天，有必要探索新的安全手段，进行GNCSCs介导的基因治疗，GNCSCs移植研究使人们看到了从根本上治愈先天性巨结肠的希望，相信在不久的将来，这一领域的研究将会有新的突破。
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