王 爽，范振海，王钰莹，喻皇飞，刘祖林，胡锡阶，余丽梅
(遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州遵义 563099)
人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB－MSCs)的研究始于本世纪初［1］，因其具有来源广泛、易于采集保存、不涉及伦理问题、对产妇及新生儿无伤害、增殖能力强、免疫原性低等优势，且具有向神经细胞、肝细胞、骨细胞、脂肪细胞等不同胚层细胞分化的潜能［2］，因而日益受到学科界关注。但是，目前关于hUCB－MSCs的体外分离培养方法不一，加上脐血中所含间充质干细胞的比例远低于骨髓，要获得较多数量的hUCB－MSCs仍有困难。研究人员大量尝试改进单个核细胞分离方法，不同密度接种，用不同的培养基培养hUCB－MSCs等。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)是最常用的完全培养基中的重要添加物，近年来不少学者［3］采用人脐血清(human umbilical cord blood serum，CBS)代替胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)成功培养出hUCB－MSCs，不但培养周期短，且能保持hUCBMSCs良好的贴壁生长能力及间充质干细胞标志蛋白的稳定表达。但因CBS的获取数量毕竟有限，难以实现较大规模的培养所需，因此，本文应用部分CBS合用FBS培养hUCB－MSCs，观察了hUCB－MSCs形态与表面标志的变化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本采集 脐带血标本来源于遵义市妇幼保健院妇产科剖宫产胎儿，并经产妇及其家属知情同意。产妇健康，排除HBV、HCV和HIV、梅毒感染者，脐血采集后4 h内进入实验流程。
1.1.2 CBS制备 采集脐带血，4 ℃静置2 h，吸取血清，2000 r/min离心10 min，留取上清，56℃水浴30 min，分装，－20℃保存备用。取部分血清检菌，无菌生长者用于后续细胞培养实验。
1.1.3 主要试剂 Oricell Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Growth medium(OHUCMSC培养基，Cyagen公司)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco 公司)，Ficoll分离液(天津灏洋)、羊抗人波形蛋白单克隆抗体(Sigma公司)，间充质干细胞流式细胞术表型鉴定试剂盒A(BD Bioscience公司)。
1.2 方法
1.2.1 脐带血间充质干细胞的分离及培养 应用Ficoll分离液从脐带血中分离单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)，离心后，吸取 MNCs，应用Beckman coulter细胞计数仪计数细胞，按5×106个/mL的细胞密度接种。应用10%FBS完全培养基悬浮细胞，37℃、5%的CO2饱和湿度下原代培养。7 d后半量换液，20～28 d逐渐形成较大的hUCB－MSCs集落，0.25%胰酶消化后，以 3%CBS+7%FBS(CBS组)或10%FBS(FBS组)的OHUCMSC培养基1∶2传代培养。
1.2.2 脐血间充质干细胞的表面标志的检测 取第5代两组细胞，参照试剂盒说明于hUCB－MSCs悬液中加入 PE 标记的 CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA－DR抗体和 CD44－PE、CD105－PerCPCyTM5.5、CD90－FITC、CD73－APC 抗体及其同型对照，孵育、洗涤、固定后，BD FACSCalibur流式细胞仪检测，Cellqust软件分析，测定hUCB－MSCs上述CD分子表达百分率。
1.2.3 脐血间充质干细胞波形蛋白的表达取第5代两组细胞爬片，滴加羊抗人波形蛋白抗体，免疫细胞化学染色，DAB显色、苏木精复染检测波形蛋白表达情况。
2 结果
2.1 原代细胞及第5代细胞形态特征 原代培养MNCs，20～28d hUCB －MSCs呈集落生长，集落周边有一定数量的破骨样细胞生长，当较大的集落的细胞融合80%后，传代培养，至第3代，细胞呈旋涡状、单一的梭型细胞生长(见图1)。
图1 倒置相差显微镜下hUCB－MSCs生长形态观察
2.2 流式细胞术鉴定 结果(见图2)。流式细胞术检测显示，两组hUCB－MSCs均高表达CD44、CD73、CD105和CD90，其中表达CD44和CD73细胞的百分率达99%以上，而两组细胞均不表达CD45、CD34、CD11b、CD19 和 HLA －DR。
图2 第5代hUCB－MSCs流式细胞术免疫表型分析图(n=3)
2.3 波形蛋白表达 经苏木精复染后，两组第5代hUCB－MSCs的胞浆内可见较强棕色颗粒表达，即表达较高水平的间质细胞标志波形蛋白，且均一性好，纯度大于95%(见图3)。
图3 第5代hUCB－MSCs波形蛋白免疫细胞化学染色(×200)
3 讨论
目前，对于 hUCB－MSCs的培养，多采用全FBS，或者为了提高培养率而采用全CBS进行培养。CBS可以有效地替代FBS培养间充质干细胞［4］，CBS中含多种促细胞增殖与保持干细胞特性的细胞因子，能更好地保持hUCB－MSCs的基本生物学特征，但因CBS存在采集量有限等问题，为扬长避短，在探索不同比例单独CBS、不同比例单独FBS及不同比例CBS联合FBS的基础上，确定在本研究中采用3%CBS与7%FBS混合添加至OHUCMSC培养基中传代培养hUCB－MSCs，结果发现，CBS组与通常所用FBS组一样，传代培养至第5代的hUCB－MSCs均为典型的成纤维细胞样，呈旋涡状贴壁生长，且细胞形态未发生明显改变。表明3%CBS与7%FBS的OHUCMSC培养基在5代以内均能较好的保持hUCB－MSCs的形态特征。两组第5代hUCB－MSCs也均一致地表达 CD44、CD73、CD105 和 CD90，不表达 CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA －DR，符合国际细胞治理协会规定的间充质干细胞的表型特征［5］，也同以往的研究报道一致［6－7］，即 CBS与 FBS两种血清联合或单用 FBS，第5代内均能良好的保持hUCB－MSCs表面标志，尤其是CD44和CD73高达99%。CD44是介导细胞与基质、细胞与细胞间粘附的粘附分子［8］，CD73 即胞外 －5＇－ 核苷酸酶(ecto－5＇－nucleotidase)，是重要的免疫信号分子，也参与跨膜信号转导及细胞粘附［9］，提示3%CBS与7%FBS合用培养hUCB－MSCs与10%FBS一样保持了hUCB－MSCs的迁移、粘附与免疫调节功能。波形蛋白为一种中胚层来源间充质细胞的胞浆内标志蛋白［10］。两组hUCB－MSCs胞浆均高表达波形蛋白，且表达波形蛋白细胞数量在95%以上，进一步表明，3%CBS联合7%FBS能很好地保持hUCB－MSCs的胞内标志蛋白，而没有发生明显的跨胚层改变。
本研究结果也提示，加入适量CBS，应用两种血清合用培养hUCB－MSCs，5代以内不但能保持hUCB－MSCs的形态特征与表型标志和胞内标志蛋白，可能对hUCB－MSCs的干性、分化能力及分泌等其他功能也无明显影响，这需要进一步确证。在更长的hUCB－MSCs传代培养中，CBS与FBS合用能否保持hUCB－MSCs的多种生物学特性，还有待进一步研究，且CBS与FBS合用是否能更优于单用FBS也值得深入。
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