张 艳，周旭美，姚晓东，张倩茹，兰 雪

(遵义医学院药学院药物分析教研室，贵州遵义 563099)

绥阳山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides.Hard.－Mazz.干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒，疏散风热的功能，主要用于治疗痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温热发病等［1］。山银花的化学成分复杂，且当前研究主要集中在有机酸类［2］、挥发油类［3］、黄酮类［4］、皂苷类［5］等成分，贺清辉等［6］首次从红腺忍冬藤茎乙醇提取物中分离得到灰毡毛忍冬皂苷乙。由于灰毡毛忍冬皂苷乙和绿原酸极性差别大，且前者无紫外吸收，我们采用高效液相色谱与蒸发光散射检测器联用的方法［5］同时测定山银花中的绿原酸和灰毡毛忍冬皂苷乙，以此评价绥阳山银花的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC－20A高效液相色谱仪(自动进样器:SIL－20A;输液单元:LC－20AT;系统控制器:CMB－20A;柱温箱:CTO－10ASvp;检测器:ELSD－LTⅡ)，实验室超纯水机(型号 Dura 12)，电子天平(型号FA2004N52794)。乙腈为色谱纯，乙酸、甲醇均为分析纯，水为超纯水。

1.2 试药 绿原酸(批号110753－ 200413，20 mg)，灰毡毛忍冬皂苷乙(批号111814－201102，20 mg，含量88.1%)均购自中国食品药品检定研究院。山银花采摘于贵州省绥阳县，经遵义医学院生药学教研室主任杨建文教授鉴定为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides.Hard.－ Mazz.的干燥花蕾。凭证标本存放于遵义医学院生药学标本室。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 供试品溶液 称取山银花的干燥粉末(过四号筛)0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)40 min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.1.2 单一对照品溶液 精密称取绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量，分别置5 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，制成浓度分别为绿原酸0.643 2mg/mL、灰毡毛忍冬皂苷乙 0.772 8 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.1.3 混合对照品溶液 精密称取绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量于5 mL容量瓶，加50%甲醇溶解并定容，制成含0.514 0 mg/mL的绿原酸、0.516 mg/mL的灰毡毛忍冬皂苷乙的混合对照品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 采用Phenomenex Luna C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱，乙腈为流动相 A，0.4%醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～10 min，11.5%A→15%A;10 ～12 min，15%A →29%A;12～18 min，29%A→33%A;18 ～30 min，33%A→45%A)，流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃。

2.2.2 系统适应性考察 混合对照品溶液与供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进样，HPLC色谱图见图1。理论塔板数按绿原酸峰面积计算大于1000，绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙的分离度大于1.5。

图1 混合对照品(左)和山银花样品(右)HPLC－ELSD色谱图

2.2.3 线性关系的考察 精密量取绿原酸和灰毡毛忍冬皂苷乙的对照品混合液依次稀释0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍。在上述色谱条件下，依次进样10 μL，以峰面积y与对照品溶液的浓度x进行线性回归，分别得到绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙的线性回归方程:y绿原酸=4609x－300.53(R2=0.9995);y灰毡毛忍冬皂苷乙=581 0.1x － 421.19(R2=0.998 8)。线性范围依次是:0.080 4 ～0.643 2 mg/mL，0.096 6 ～0.772 8 mg/mL。

2.2.4 精密度实验 取山银花样品约0.2 g，精密称定，按“2.1.1”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件连续进样6次，每次进样10 μL。绿原酸和灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积的RSD(n=6)分别为0.76%和0.77%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性实验 取同一山银花样品6份，各约0.2 g，精密称定，按“2.1.1”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样10 μL。绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积的 RSD(n=6)分别为0.85%、0.50%，表明本方法重复性良好。

2.2.6 稳定性实验 取山银花样品约0.2 g，精密称定，按“2.1.1”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件于 0、2、4、8、12、24 h 分别进样 10 μL。绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积RSD(n=6)分别为1.5%、2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.2.7 加样回收率实验 取山银花样品9份，各约0.2 g，精密称定，按“2.1.1”项制备供试品溶液，各取5 mL供试品溶液于10 mL容量瓶，加入一定体积的绿原酸对照品溶液及灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液，50%甲醇定容，0.45 μm 滤膜过滤，按“2.2.1”项色谱条件进样 10 μL，加样回收率结果(见表1、表2)。

表1 绿原酸加样回收率结果

表2 灰毡毛忍冬加样回收率结果

2.2.8 样品含量测定 取山银花样品6份，各约0.2 g，精密称定，按“2.1.1”项制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样 10 μL，含量测定结果(见表3)。

表3 山银花样品含量测定结果

3 讨论

蒸发光散射检测器可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。蒸发光散射检测器灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联［7］。绿原酸与灰毡毛忍冬皂苷乙的极性差别较大，需要用梯度洗脱进行同时含量测定，蒸发光散射器很好的解决了梯度变化过程中基线不稳的问题。

本研究建立了HPLC－ELSD联用的方法［8－9］，可同时测定绥阳山银花中的的绿原酸成分和灰毡毛忍冬皂苷乙的含量，绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量分别为4.45%、7.94%，均高于2010版《中国药典》一部规定的2.0%和5.0%，说明绥阳山银花的品质较好，绥阳山银花具有潜在的深度开发价值。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.中国医药科技出版社，2010:28－29.

［2］Wu H Z，Luo J，Yin Y X，et al.Effects of chlorogenic acid，an active compound activating calcineurin，purified from Flos Lonicerae on macrophage［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25(12):1685 －1689.

［3］李会军，张重义，李萍.忍冬不同药用部位挥发油成分分析［J］.中药材，2002，25(7):476 －477.

［4］Chen J，Li S L，Li P，et al.Qualitative and quantitative analysis of active flavonoids in Flos Lonicerae by capillary zone electrophoresis coupled with solid－phase extraction［J］.Journal of Separation Science，2005，28(4):365 －72.

［5］Li H J，Li P，Ye W C.Determination of five major iridoid glucosides in Flos Lonicerae by high－performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection［J］.J Chromatogr A，2003，1008(2):167 －172.

［6］贺清辉，李会军，毕志明，等.红腺忍冬藤茎的化学成分［J］.中国天然药物，2006，4(5):385 －386.

［7］Chai X Y，Lin S，Li P.Quality evaluation of Flos Lonicerae through a simultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD［J］.Journal of Chromatography A，2005，1070(1－2):43－48.

［8］张璐，曾文雪.HPLC－ELSD同时测定山银花中绿原酸、木犀草苷和川续断皂苷乙的含量［J］.江西中医学院学报，2011，23(4):40 －42.

［9］李会军，李萍.HPLC－ELSD法测定金银花中常春藤皂苷元及齐墩果酸的含量［J］.药物分析杂志，2006，26(6):820－822.