赵春华,毛晓晶,韩 钦
(中国医学科学院 基础医学研究所，北京协和医学院 基础学院组织工程中心,北京 100005)
干细胞分化调控的分子机制一直是生命科学研究领域的焦点。在过去几年里,该领域的研究主要集中在干细胞所处的微环境,环境信号分子如TGF-β、Wnts和Notch等在调控干细胞分化中所起的作用。干细胞从自我更新状态向特定谱系分化的转变过程总是伴随细胞形态和功能的改变,这些改变很大程度上由基因的差异表达决定。具体地讲,干细胞自我更新相关基因关闭,细胞类型特异性基因转录激活。因此,研究干细胞分化的内源性调控因素日益受到重视。
近几年，越来越多的研究集中于理解干细胞干性特征及其分化过程的遗传学和表观遗传学调控。干细胞分化涉及到基因组范围内多个基因座大规模改变，DNA甲基化以及各种各样组蛋白修饰都有变化。表观遗传机制被定义为除了基因组序列以外的可遗传密码，包括组蛋白翻译后修饰，DNA的CpG二核苷酸甲基化，ATP依赖的染色质重塑，组蛋白和组蛋白变异体的交换，以及非编码RNA分子[1]，在基因转录调控中发挥重要作用。哺乳动物基因组有复杂的DNA甲基化和组蛋白修饰谱系,这种体系构成表观基因组(epigenome)[2]。
本综述旨在初步阐明表观遗传的概念和基本内容，胚胎干细胞(ES)基因组的表观遗传特征和分化过程中表观遗传的动态变化，以及DAN甲基化和组蛋白修饰之间的关系。
1 表观遗传学概念和内容
经典的表观遗传学定义为DNA或染色质上可有丝分裂遗传的修饰，不改变原始的核苷酸序列[3]。细胞分化的实质是基因选择性表达。基因在细胞和组织中特异性表达，传统上认为受细胞/组织中活跃的转录因子调控，但是转录因子调控一般有局限性，并且在应答环境和细胞外刺激时迅速变化。各种各样的基因表达同时受到表观遗传系统的DNA甲基化和组蛋白修饰控制。
1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是表观基因组关键成分，通过启动子CG二核苷酸序列甲基化抑制基因表达，此外DNA甲基化还定位于基因组异染色质上和重复元件中。DNA甲基化比组蛋白修饰更能维持长期抑制，并且动态性没有组蛋白修饰明显[4]。DNA甲基化通过细胞有丝分裂负责特异基因表达模式稳定维持，被认为是基因表达状态稳定的主要因素。
哺乳动物中，DNA甲基化由DNA甲基转移酶(Dnmts)在5’-CG-3’二核苷酸(CpG岛)上起作用实现，5-甲基胞嘧啶(5-MeC)是基因组DNA中唯一的化学修饰。甲基化CpGs在细胞传代时可遗传。小鼠基因组超过60%CpG甲基化，大部分在重复元件(包括中度重复和卫星DNA)上，起到抑制转座，提高基因组稳定性作用。5-MeC存在于独特序列中的数量少于存在于重复序列中。最近研究发现DNA甲基化以组织或细胞特异性方式表达，调控更多基因表达，调控多样的细胞过程，包括发育基因调控，X染色体失活，基因组防御和基因组印记[17]。
DNA甲基转移酶有两种，分别是维持甲基化酶和从头甲基化酶。Dnmt1把甲基团加到只有一条链甲基化的半甲基化DNA上，和甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)直接相互作用，在复制期间给子链甲基化，维持亲代DNA甲基化模式。Dnmt3a, Dnmt3b在试管内可以从头甲基化，体内敲掉以后，随着细胞传代次数越多，甲基化进行性损失，所以又有维持甲基化的功能[2,16]。
DNA甲基化模式在哺乳动物发育期间由DNA转移酶家族有序构建，开始于受精卵发育数小时内细胞分裂期雄原核发生一波去甲基化之后，接下来在胚胎植入后基因组范围内从头甲基化开始。原肠胚期由于从头甲基化基因组DNA甲基化程度很高，分化期间在特异性组织中DNA甲基化水平倾向于降低[3,5,15,23]。
DNA甲基化介导的基因调控通过两个机制起作用。第一，在转录因子结合元件内的CpG甲基化直接干扰某些转录激活剂和靶序列的结合 。第二，更一般地，甲基化基因通过含有甲基化CpG结合域(MBD)的蛋白家族起作用，比如MeCP2和MBD1,他们结合甲基化CPG岛，抑制基因表达。这些MBD蛋白本身是转录抑制剂，进一步耦联其他辅阻遏蛋白和组蛋白修饰酶，导致抑制性染色质重塑和基因沉默[18,21]。
1.2 组蛋白修饰 组蛋白修饰在调控细胞特异性基因表达过程同样发挥重要作用。组蛋白修饰是另一种形式表观遗传调控，是指翻译后修饰加到组蛋白N端尾巴上，暴露在核小体外面。到目前为止，核心组蛋白上(H2A，H2B，H3，H4)上有60多个不同残基已经报道可进行修饰，这些修饰包括乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化，SUMO修饰，ADP核糖基化和脯氨酸异构化等。有几种组蛋白修饰和5-MeC相协调。这些表观遗传标记一般和染色质凝集有关，染色质凝集在沉默基因，稳定染色体结构，抑制逆转座子移动方面起作用。[2]除此之外，通过组蛋白替换——插入组蛋白变异体的方式，组蛋白修饰能够重置。
不同组蛋白修饰之间有着协同或拮抗作用，去应答合适的发育信号调控基因表达。组蛋白赖氨酸甲基化能作为抑制或者激活标志。特别是，在组蛋白H3上的赖氨酸K4和赖氨酸K27甲基化已显示分别和基因表达激活和抑制相关，两种修饰分别通过Trithorax(TrxG)和Ploycomb(PcG)蛋白复合体起作用，在谱系特异性发育过程中发挥关键作用。K9和K27一样，甲基化一般和沉默区域相关。
组蛋白修饰和激活的或抑制的染色质状态相关，在转录起始和延长中起作用[6]。组蛋白乙酰化和去乙酰化决定了染色质的转录活性。组蛋白H3/H4乙酰化中和了正电荷，使临近核小体之间的相互作用消失，协调促进包装染色质纤维的解折叠，并把DNA模板暴露给了转录因子，此外H3K4甲基化直接把转录激活剂拴在了染色质上，一般和转录激活相关。染色质重塑蛋白Chd1结合甲基化H3K4，募集SAGA(乙酰基转移酶)，这些修饰位于常染色质内；相反，H3K9甲基化，H3K27甲基化促进了紧密的异染色质结构形成，各自募集异染色质相关蛋白1(HP1)和多梳抑制复合体1(PRC1)，这些修饰和基因沉默有关。H3K27甲基化介导的抑制和兼性异染色质有关，然而在一些环境中H3K9甲基化介导的抑制和组成型异染色质有关[1]。
组蛋白的翻译后修饰模式形成综合性的组蛋白密码(histone code)，不仅仅代表基因活化或抑制的一种状态，更通过染色质构象改变控制基因表达[7,14,17]。组蛋白密码的存在将基因组分成激活区域、抑制区域和静息状态待激活区域[8]。在基因转录期间，一方面由于转录因子和RNA多聚酶Ⅱ募集染色质修饰酶，所以组蛋白修饰动态变化，而另一方面组蛋白修饰酶的组合先于转录因子存在，因此指导转录因子结合[14]。特征最明显的组蛋白修饰就是赖氨酸乙酰化。H3Ac, H4Ac发现于转录激活染色质中。组蛋白甲基化表观遗传调控，被认为很稳定，涉及到某些基因组区域长期维持。然而，最近发现了组蛋白去甲基化酶，揭示了组蛋白甲基化比以前所认为的要更加灵活。到目前为止，至少有5种可以甲基化的赖氨酸位置在H3 (K4, K9, K27, K36, and K79)上，一个在 H4 (K20)上。另一层复杂性在于有3种不同的甲基化状态，即单甲基化、二甲基化、三甲基化 (monomethylated, dimethylated, or trimethylated)状态，控制特异位点的转录能力。组蛋白修饰谱在基因组非重复区域，和DNA甲基化谱一样也是组织细胞特异性的。H3K4，K36，K79甲基化导致转录激活。然而，H3K9，H3K27以及H4K59甲基化和转录沉默相联系[7]。
表观遗传信息能够通过连续的细胞分裂而传递，表观遗传能够遗传(epigenetic inheritance)详细机制在其他综述中已有报道[6]，这也提示我们：染色质在发育期间维持转录模式过程中发挥重要作用[6,9]。
1.3 染色质重塑 染色质重塑是表观遗传的重要内容之一，它是指染色质位置和结构的变化，是在能量驱动下真核细胞核小体在DNA上重新定位或排列的过程，它改变了核小体在基因启动子区的排列，增加了基因转录装置和启动子的可接近性。染色体重塑主要有2种类型，一是依赖ATP的物理修饰，通过ATP水解所释放的能量改变核小体和组蛋白构型；二是通过对核心组蛋白N端尾部进行共价性化学修饰，包括组蛋白末端乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等，直接影响核小体的结构，并为其他蛋白提供DNA结合位点。
在表观基因组形成时涉及到几种“表观遗传因子”，比如DNA甲基转移酶(Dnmts)、组蛋白甲基转移酶(HMTs)、组蛋白乙酰转移酶 (HAT)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、DNA甲基化识别结合蛋白(MBD)、组蛋白甲基化识别结合蛋白、染色质重塑因子等其他分子，这些分子之间相互关联，彼此影响定位，影响功能发挥。这些分子可以形象的称为表观遗传密码中的阅读者(readers)、书写者(writers)和清除者(erasers)[3]。
不同染色质状态之间的过度是高度动态性的，依靠维持转录沉默状态的因素如组蛋白去乙酰化酶HDAC、H3K9甲基转移酶和促进沉默状态起始转录的因素如组蛋白乙酰转移酶HAT、H3K4甲基转移酶进行平衡。这些平衡因素破坏就会将染色质平衡状态转变成激活的或抑制的染色质构象[5]。
1.4 非编码RNA分子 Non-coding RNA以RNA依赖的方式直接指导DNA甲基化和组蛋白修饰。
2 表观遗传学和干细胞分化的关系
胚胎干细胞ESCs来源于哺乳动物胚泡内细胞团，有无限自我更新潜能，并且能在体内分化成各种类型体细胞。数十年来发育生物学家面临的一个主要挑战就是去阐明结构和功能上不同的器官组织是怎么由遗传相同细胞构建的。一个特别令人困惑的问题就是一个胚泡里临近位置的多潜能干细胞所暴露的外界环境相同或相似，最后却分化成不同细胞谱系[1]。
2.1 ES表观遗传图谱维持多潜能性 我们尝试揭开干细胞维持干性特征(stem cell signature)，也就是未分化状态的分子机制，进一步理解组织特异性基因如何在发育完晚期进行表达，在ES细胞中不表达却保留表达潜能，显然只有转录谱的信息量不够，越来越多的研究发现表观遗传学同样发挥重要作用[6]。有研究表明干细胞主要通过一些主要转录因子的表达、表观遗传学的调控和非编码RNA(如miRNAs)的作用来维持其多潜能性和自我更新能力，进而形成一个相互调控和依存的网络[4,10]。
多潜能细胞有独特的表观遗传特征反映其广泛的发育潜能，其表观遗传图谱(epigenetic landscapes)可能是细胞过去发育状态、现在发育状态、将来发育潜能的敏感指标[3]。在野生型ES细胞和体细胞中，CpG岛甲基化水平呈现两种模式分布，大部分基因组区域或者是大规模非甲基化或者是大规模甲基化的。CpG岛甲基化状态和局部CpG岛密度高度相关。ES细胞几乎所有含大量CpG岛的启动子都富含H3K4me3而没有DNA甲基化，因此这些位点的基因转录活性高。ES细胞中含少量CpG岛的启动子，一般和组织特异性基因相关，其中大部分是DNA甲基化的，只有不到10%含有H3K4me2/me3，因此谱系决定基因在ES中沉默，这也从侧面反映DNA甲基化和组蛋白修饰紧密相关。相似地，所有ES的多潜能基因是DNA甲基化水平低，H3K4甲基化水平高，因此多潜能基因高表达，维持干性状态。ES中非CpG岛处DNA甲基化水平非常低，体细胞非CpG岛处中几乎检测不到。
和ES细胞DNA甲基化图谱类似，ES细胞中染色质状态图也很多。总体上来说，多潜能细胞染色质结构开放，激活的染色质区域(常染色质)广泛，有高转录活性，而谱系决定区存在高度凝集的转录失活异染色质。在hESC中几乎75%的启动子(活化和失活)富含H3K4甲基化，组蛋白标记的综合图谱很复杂，抑制性H3K27me3和激活性H3K4me3共定位，H3K4me3 and H3K56ac也存在共定位，基因沉默区包括转座子和重复序列通常有异染色质标记H3K9me3和H4K20me3，中心粒异染色质处还有H3K64me3[3]。
2.2 细胞分化期间表观遗传学动力学变化 细胞分化涉及到基因组范围内多个基因座大规模改变，DNA甲基化和去甲基化以及各种各样组蛋白修饰都有变化[2]。首先，DNA甲基化是分化期间发育调控者之一。ES细胞含有低水平的DNA甲基化，分化期间又获得DNA甲基化导致谱系特异性基因沉默，而多潜能基因也变成DNA甲基化的，在分化后细胞中保持多潜能基因沉默。在造血干细胞、B淋巴细胞、上皮前体细胞中发现删除DNMT1，会引起分化相关基因异常表达，造成异常分化[3]。
ES细胞和分化体细胞一样，对于激活基因转录采用相似表观遗传机制。然而，最近有证据表明在ESCs中，有独特组蛋白修饰机制，沉默谱系特异性基因，从而在ESC中不转录，但在随后的分化期间激活[1]。
根据基因组研究，大多数发育需要的转录因子和多潜能基因在在多潜能状态下是非DNA甲基化的。ES细胞中和分化细胞比较也发现：ES细胞中染色质通常不是致密压缩状态，更多的是处于转录允许状态，由H3K4甲基化和H3K27甲基化维持平衡，不包含H3K9甲基化[6]。这里将提到双向染色质(bivalent chromatin)的概念，ES基因组范围内染色质图谱显示：一大部分发育和组织特异性基因同时含有抑制性的修饰H3K27me3和激活修饰H3K4me3，这种激活和抑制染色质标记紧密并存，就称为双价修饰，相应的基因在多潜能的ES中低水平表达，事实上这些位点处于静息状态，在发育过程中准备激活，这说明一种多潜能细胞基因调控新模型，许多重要的组织特异性调控基因预备表达，但是起反作用的组蛋白修饰使其维持在待命状态，去应答合适的发育信号。分化期间，这种双向染色质谱一般裂解，导致组织特异性基因转录激活，另外的发育途径相关位点沉默。这些双向染色质不局限于ES细胞，还发现于造血干细胞、神经前体细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞/卫星细胞、成纤维细胞、T细胞中，成体干细胞在体内环境中要适当再生细胞池，共价修饰是保持谱系灵活性的共同特征已有研究验证，双价染色质修饰可能是胚胎干细胞和成体干细胞的共同特征，有研究猜测一旦细胞变成终末分化状态，双向修饰才将完全关闭[6,11,14]。
当ESCs要分化成特定谱系时，抑制性组蛋白修饰会从所需要的谱系控制基因座清除，激活性修饰会维持，因此允许转录起始。正相反，当ESCs经诱导已分化成其他细胞谱系时，激活性组蛋白修饰会清除而抑制性修饰会维持，因此表达后基因会稳定沉默。只有一部分关键发育基因和谱系控制基因在ESCs中有共价染色质结构，然而，其他谱系控制基因有不同组蛋白修饰模式，可能以非特征性的表观遗传机制，允许基因在发育晚期阶段激活。当然，双价组蛋白修饰和DNA甲基化相比，在快速诱导分化条件下显示出更大灵活性[1]。
通过不同组蛋白修饰以及他们和转录活性的紧密相关性，有研究报道ES细胞基因组中所有基因能分成3个不同部分：10278个基因只含H3K4me3，1798个基因含有H3K4和K27me3,5393个基因这两种修饰都不含。GO分析显示只有H3K4甲基化修饰的这类基因牵涉到与增殖相关的生物学过程，比如核酸代谢、细胞周期进展、蛋白质和DNA代谢也非常丰富，这些基因普遍和ES细胞的自我更新特性有关联。在所有共价修饰的基因目录中，即时分化所必须的生物学过程更加丰富，比如外胚层发育、神经发生、转录调控和信号转导等。最后，没有H3K4me3或者H3K27me3修饰的这类基因大多呈现于谱系特化过程以及机体和环境刺激相互作用过程，比如味觉、知觉、免疫、防御过程。
总之，这些数据揭示ES细胞基因组不同的功能分区，与不同的组蛋白H3三甲基化谱和基因表达活性相关，CHIP-PET测序分析描绘的人ES细胞基因组内组蛋白H3K4和K27甲基化模式，确定了ES细胞自我更新特性、多潜能维持和谱系特化潜能[9]。
2.3 干细胞表观基因组和成体细胞区别 干细胞与成体细胞相比，表观基因组有高度延展性和应答性，多个证据支持这个模型。首先，ESCs和分化细胞相比，有更多双价或静息(bivalent/poised)启动子，这些标志重要的发育调控者基因。其次，胚胎干细胞、成体干细胞与分化细胞相比，启动子处DNA甲基化和H3K27me3水平更低[14]。 而分化后细胞多潜能基因比如Oct4处，DNA甲基化、H3K9me3和H3K27me3水平升高，沉默多潜能基因[4]。
为了更好地理解多潜能和分化细胞中的表观基因组图谱(epigenomic landscapes)，探索全基因组范围内组蛋白修饰和DNA甲基化的关系，Hawkins, R.D.,实验室在H1人胚胎干细胞(hESCs)和胎儿肺成纤维细胞(IMR90)中综合分析了11个组蛋白修饰，而且最近获得了基因组范围核苷酸DNA甲基化的分辨图。分化细胞和hESC相比，有更大规模或者说扩大化的H3K9me3和H3K27me3区域，有选择性地影响多潜能、发育、谱系特异功能。hESCs和IMR90、CD4+T细胞以及其他谱系特异性细胞，正常细胞和癌细胞相比，抑制性染色质结构增加，H3K27me3覆盖区域扩增，双向的ESC染色质状态通常过度到H3K27me3的形式，并扩展到覆盖整个基因座和临近基因座。不同谱系分化细胞，覆盖的基因不相同。基因本体分析发现被H3K27me3扩增标记的基因，和发育过程相关。这些结果都说明：细胞命运决定也是表观遗传基因抑制过程，不同细胞谱系有其独特性。H3K9me3和H3K27me3类似，在IMR90中比hESC扩大化了，但是不是所有H3K27me3标记位点都存在H3K9me3，这种在特异调控位点双重抑制可能是强调该基因在分化细胞中维持沉默的重要性。H3K9me3单独出现足够抑制基因表达，并且H3K9me3覆盖区域扩增对基因抑制影不大。相反，窄区域的H3K27me3标记出现不足以沉默基因，因为他们通常是双价状态，但是H3K27me3覆盖区域的扩大似乎能够维持分化细胞稳定的基因表达沉默状态，分化细胞失去大部分干细胞可塑性[4]。
3 DNA甲基化和组蛋白修饰之间的相互作用
有直接的证据表明表观遗传机制存在相互交联，H3K9甲基转移酶HKMT和DNA甲基转移酶DNMTs直接结合，证实了H3K9/27甲基化和 DNA甲基化相联系。另外，涉及DNA甲基化和H3K9/K27甲基化的蛋白质分子之间相互作用，DNA甲基化是募集H3K9/2K27甲基化分子的基础，反之亦然[2,17]。
DNA甲基化和其他组蛋白修饰比如乙酰化也有互相依赖的关系，DNA甲基转移酶(Dnmt1,Dnmt3a)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)相互作用，起到抑制转录作用[18]。
DNA甲基化在高度有序染色质构成中起作用，促进染色质动力学变化。各种不同的组蛋白修饰和染色质重塑一般反映了整个基因组的DNA甲基化状态，所以分析DNA甲基化谱，能帮助我们了解整个基因组的表观遗传状态。然而，HKMT G9a的SET区域突变不能减轻DNA甲基化，说明除HKMT还有其他因素确保DNA甲基化发生[2]。
表观遗传标记系统已被证明，互相增强转录状态，以至于特异的组蛋白修饰和DNA甲基化很可能共定位。染色质印记区失活的DNA甲基化基因，组蛋白H3K9同样甲基化，H3、H4低乙酰化，而激活的基因DNA非甲基化、组蛋白H3K4是高乙酰化高甲基化的[7]。双价启动子是典型低甲基化的，H3K4me3和甲基化的CG二核苷酸(mCG)反相关，H3K27me3和启动子处DNA低甲基化相关。DNA甲基化和组蛋白修饰复杂之处还在于不同细胞中，有细胞类型特异的DNA甲基化和组蛋白修饰的关系[4,12,15,20]。 到目前为止，仍然要确定是否有其他染色质结构或调控元件和DNA甲基化相关。
4 结论
细胞类型特化由组织特异性转录因子和许多表观遗传调控者共同控制。表观基因组对哺乳动物发育和细胞分化机制研究提供新视野。DNA甲基转移酶,组蛋白修饰酶，组蛋白亚类，染色质重塑因子，和非编码RNAs直接或间接相互作用，揭示了细胞类型特异的表观基因组的建立。DNA甲基化和组蛋白修饰彼此关联。多潜能干细胞提供了一个有力模型去研究细胞分化期间表观遗传修饰相互作用和动力学[3]。
我们现在处与表观基因组的时代，基因组的全部表观遗传标记信息，即表观基因组。表观基因组和基因组及转录组相连系，引进了另一层次遗传控制的方式。许多基因的遗传活性有稳定记忆，遗传到下一代，对于维持干细胞池特别重要[14,22]。随着技术领域的发展，我们已经有了单核苷酸分辨率的人类基因组DNA甲基化图谱和许多基因组范围内染色质图谱，能帮助我们理解各个细胞类型之间转录调控和表观遗传调控[2-3,24]。
通过比较多潜能干细胞和分化细胞的表观基因组，发现谱系特异细胞以扩大化的异染色质区域为特征，他们选择性的去影响多潜能和发育相关基因，提示我们表观遗传机制在细胞分化和维持分化细胞状态过程中发挥关键作用，所以同样的基因组序列产生各种各样的细胞类型，有不同基因表达谱和细胞功能[4]。
5 展望
干细胞，特别是胚胎干细胞，是研究自我更新、谱系确定和细胞分化极有力的工具。理解ES细胞和其他干细胞群体表观遗传学的进展，对于干细胞安全应用于临床非常重要。比如说要确保ES细胞来源的细胞在移植前完全分化，是谱系限制性的，已有效关闭其他基因。将来对多潜能细胞到终末分化细胞表观遗传状态的进一步特征化，对我们理解谱系决定的分子机制和ES细胞安全应用于临床非常有意义[6]。
干细胞分化过程表观遗传学调控机制的研究，无疑是当今医学和生命科学的重点研究方向，有利于寻找人类疾病有潜力的预测、诊断指标和治疗靶标。对干细胞分化过程表观遗传学调控机制的深入研究，将提高对人及动物发育过程中发育机制的认识，并提高对干细胞实行定向诱导分化的能力，为干细胞在发育生物学、遗传学和再生医学等领域的应用提供完善坚实的理论基础。不同细胞表型和表观遗传模式之间的建立途径，不同表观遗传修饰之间互相调控性作用以及表观遗传标记靶向基因组特定区域的机制很大程度上还不清楚，将来需要该领域的研究者进一步攻克难关[19]。
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