DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

李长福，梁大敏，束 波，杨加伟，生 欣，范 芳

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

在细胞的生存过程中DNA会遭受各种内外源性因素的损伤，使DNA发生单链或双链断裂(double-stranded breaks, DSBs)，如果这些损伤得不到及时修复，可引起细胞基因组不稳定性增加，最终导致细胞死亡，这也是抗癌药物致肿瘤细胞死亡的主要机制[1-2]。非同源重组修复(nonhomologous end-joining，NHEJ)是哺乳动物细胞中最重要的一种修复机制， DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是NHEJ的核心组分，在DSBs修复及癌症预防方面发挥重要作用[3-4]。

为进一步研究DNA-PKcs在NHEJ修复通路及肿瘤细胞DNA损伤修复中的作用，本研究将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU，观察DNA-PKcs基因沉默对其下游分子Artemis的激活作用，探讨DNA-PKcs基因影响肝癌细胞Bel7402/5-FU 耐药性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PRNAi-U6.1-Neo shRNA质粒(百奥迈科生物科技有限公司)，BEL7402/5-FU细胞株(南京凯基公司)， LipofectamineTM2000 Reagent(Invitrogen公司)，DNA-PKcs抗体(Assay biotech公司)，Artemis抗体及P-Artemis抗体(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%FBS、20 μg/mL 5-FU的1640培养液培养BEL7402/5-FU细胞，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，细胞贴壁生长，隔天传代。

1.2.2 细胞转染 将培养好的BEL7402/5-FU细胞分为4组：空白对照组、脂质体组、空质粒组和shDNA-PKcs转染组。细胞计数后，将BEL7402/5-FU细胞按8×104细胞/孔接种于6孔培养板中，当细胞生长到70%～80%融合时进行转染，按200 μL/孔将质粒-脂质体复合物加至相应培养孔中，6 h后换液。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测DNA-PKcs mRNA水平的表达 按Trizol®Reagent试剂盒说明书提取各组细胞总RNA行real-time PCR扩增，DNA-PKcs及β-actin引物见参考文献[5]。实验组和对照组DNA-PKcs mRNA表达量通过公式2-( △△CT)分析计算。

1.2.4 Western blot检测DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白表达 按常规方法提取各组细胞总蛋白，BCA法计算样品蛋白浓度。取50 μg蛋白样品与上样缓冲液混匀，SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，室温封闭1h，加一抗4℃过夜，用TBST洗膜3次。加二抗37℃孵育1h后TBST洗膜3次，用ECL发光液显色曝光，Quantity One定量分析软件分析灰度比。

2 结果

2.1 DNA-PKcs mRNA水平表达 实时荧光定量PCR检测结果显示(见图1)：各对照组细胞中DNA-PKcs mRNA表达无明显差异(P>0.05)，shDNA-PKcs转染组DNA-PKcs mRNA的表达较对照组明显下调(P<0.01)。

**:与空白对照组相比图1 各组细胞DNA-PKcs mRNA相对表达量

2.2 DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表达 转染shDNA-PKcs 48h后收集细胞，通过Western blot检测各组细胞DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表达。Western blot检测结果显示(见图2～4)：各对照组细胞中DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白的表达无明显变化(P>0.05)；shDNA-PKcs转染组DNA-PKcs、Artemis蛋白表达均下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；shDNA-PKcs转染组P-Artemis蛋白表达与对照组比较无差异 (P>0.05)。

A：空白对照组;B：脂质体组;C：质粒对照组;D：shDNA-PKcs转染组。图2 各组细胞DNA-PKcs、Artemis和P-Artemis蛋白表达情况

**:与空白对照组相比 P<0.05。图3 各组细胞DNA-PKcs蛋白的表达

**:空白对照组相比 P<0.05。图4 各组细胞Artemis和P-Artemis蛋白表达情况

3 讨论

目前认为，肿瘤的发生与细胞DNA损伤及其修复机制缺陷有关，而肿瘤细胞对放化疗的敏感性主要取决于细胞DNA损伤修复的能力。NHEJ是哺乳动物细胞中最重要的一种修复机制，DNA-PKcs是NHEJ的核心组分，在DSBs修复及癌症预防方面发挥重要作用[3-4]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，在DNA损伤修复、细胞周期检测及肿瘤耐药中均起关键作用。

DNA -PKcs是由4128个氨基酸组成的相对分子量为469kD的大分子量蛋白质，当细胞发生DSBs时，DNA-PKcs招募NHEJ中的组分Ku70/80迅速结合到DNA断端，通过自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如Artemis、DNA ligase4、XRCC4等对损伤DNA进行修复[6-7]。DNA-PKcs被认为具有肿瘤抑制功能，能维持基因组稳定性。目前已有一些研究表明下调DNA-PKcs能增加肿瘤细胞对药物的敏感性[8-9]。在NHEJ中，Artemis是DNA-PKcs的下游靶分子，具有多个DNA-PKcs的磷酸化位点[10-12]。本课题组前期研究工作发现：转染靶向DNA-PKcs的干扰质粒后，肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU对化疗药物的敏感性增加[5]，而DNA-PKcs是NHEJ修复通路中的核心组分，说明肿瘤细胞中DNA损伤修复与肿瘤耐药有关。为进一步了解DNA损伤修复与肝癌细胞耐药的机制，观察肝癌耐药细胞在DNA损伤修复过程中DNA-PKcs基因对其下游靶分子的激活情况，探讨NHEJ修复通路肝癌耐药中所起的作用，本实验用Western blot法检测了转染shDNA-PKcs后各组细胞Artemis、P-Artemis蛋白表达情况，结果显示DNA-PKcs沉默后肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU中DNA-PKcs及Artemis蛋白表达减少，说明DNA-PKcs表达的抑制可以下调其下游靶分子Artemis的表达；而转染组P-Artemis表达与对照组相比无差异，说明DNA-PKcs的沉默不能抑制Artemis的磷酸化，因此推测Artemis不仅是DNA-PKcs的下游靶分子，还有可能是其他信号通路的靶分子。事实上，有研究表明Artemis参与NHEJ修复过程中还需要ATM的激活[13-14]。因此DNA-PKcs沉默所致Bel7402/5-Fu细胞耐药性降低，不一定与DNA-PKcs/Artemis通路有关，可能还有其他信号通路共同参与，其作用机制还需要进一步研究。

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