孟胤妤，蒋成素，尤孟媛，李会兴，肖雁冰
(遵义医科大学附属妇幼保健院 妇科，贵州 遵义 563000)
左炔诺孕酮宫内节育系统(Levonorgestrel-releasing intrauterine system, LNG-IUS )商品名为“曼月乐”，近年逐步被应用于非避孕领域的相关研究，已被广泛用于子宫腺肌病的临床治疗[1-3]。前期研究发现，当LNG-IUS用于治疗子宫腺肌病时存在“病灶阈值”现象[4-5]，即LNG-IUS治疗子宫腺肌病效果存在病灶大小的选择性，这使得我们考虑，在使用LNG-IUS治疗子宫腺肌病时，其有效成分LNG可能在子宫肌壁存在一定的浓度梯度，随着子宫肌壁厚度的增加，LNG的浓度逐渐降低，直至失去治疗效果。为了弄清LNG-IUS治疗子宫腺肌病存在“病灶阈值”现象的内在原因，为正确应用LNG-IUS治疗子宫腺肌病提供参考，本研究是在前期研究的基础上，通过改进体模材料、制备技术制得透明硅胶体模(Transparent silica gel model, TSM)，并对LNG进行显色标记，以颜色变化的形式直观反映M-LNG在TSM壁中的浓度变化，并对M-LNG的弥散规律进行研究，以期为LNG-IUS治疗子宫腺肌病存在“病灶阈值”现象的学术观点提供实验证据，并为宫内药物缓释系统的研究探索实验平台。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料 A、B两种组分的室温硫化硅胶(东莞市国创有机硅胶有限公司)；左炔诺孕酮标准品(纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司)；氨基磺酸(成都科隆化学品有限公司)；异烟肼(纯度≥98%，成都科隆化学品有限公司)；甘油(浙江遂昌惠康药业有限公司)；无水乙醇分析纯(天津永创化学试剂厂)；蒸馏水。
1.2.2 M-LNG与LNG性质测定 使用无水乙醇溶液对紫外分光光度计进行基线校零，取10 mL 10 mg/mL M-LNG溶于10 mL无水乙醇溶液配制成5 mg/mL M-LNG乙醇溶液，取50 mg LNG溶于10 mL无水乙醇溶液配制成5 mg/mL LNG乙醇溶液，再使用紫外分光光度计对已配制好的相同浓度的M-LNG乙醇溶液及LNG乙醇溶液进行光谱分析。
1.2.3 TSM的制备及其理化性质测量 将A、B两种组分的室温硫化硅胶按照1∶1的比例分别取250 mL放入500 mL烧杯中，使用电动搅拌机搅拌均匀，再使用真空消泡桶进行抽真空脱泡处理，脱泡完毕后将试管插入正中并固定，再将硅胶于室温中静置4h，待硅胶固化后抽出试管，即可制得TSM。在37 ℃条件下观察TSM的质地、状态、颜色及其稳定性；根据固体密度计算公式：ρ=m/v，计算出TSM的密度。
1.2.4 建立标准曲线 因LNG不溶于水，可溶于乙醇溶液，为了制定M-LNG标准曲线，将不同质量的M-LNG分别加入10 mL无水乙醇中，配制成M-LNG浓度分别为0.02、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液，利用紫外分光光度计，在波长为345 nm处测得不同浓度M-LNG的标准液的吸光度，并根据吸光度绘制M-LNG标准曲线。
1.2.5 M-LNG放入TSM后TSM的颜色变化、M-LNG的吸光度测定及浓度计算 取5 mL 10 mg/mL M-LNG溶液加入5 mL甘油中，充分搅拌均匀。将30份已配制好的该溶液放入30个TSM腔中，并用石蜡封存，放入37 ℃恒温水浴箱中进行观察。将30个已加入M-LNG的TSM按照观察天数随机分为3组，每组10个，并将1个未加入M-LNG的TSM作为空白组进行对照。每30 天记录1次，30 、60、90 d后观察TSM的颜色变化，并将放置30、60 、90 d的TSM分别取出4个，以TSM腔壁为中心，向外在1、2、3、4 cm处分别切片，厚度为1 cm[6]。将放置30 d的TSM分为第1组，其中距离TSM腔壁1 cm为A1组、2 cm为B1组、3 cm为C1组、4 cm为D1组；将放置60 d的TSM分为第2组，其中距离TSM腔壁1 cm为A2组、2 cm为B2组、3 cm为C2组、4 cm为D2组；将放置90 d的TSM分为第3组，其中距离TSM腔壁1 cm为A3组、2 cm为B3组、3 cm为C3组、4 cm为D3组。以TSM切片中心为基准，取15 g置于已加入10 mL无水乙醇的密闭离心管中，并放置于37 ℃恒温水浴箱中，24 h后取出该溶液，利用紫外分光光度计测出M-LNG的吸光度，再根据已测得的曲线回归方程计算出M-LNG的浓度。
2 结果
2.1 M-LNG显色效果 制成的氨基磺酸异烟肼水溶液呈无色(见图1)，制成的M-LNG呈黄色(见图2)，置于37 ℃条件下观察90 d均未变色。
图1 制成的氨基磺酸异烟肼水溶液
图2 制成的M-LNG
2.2 M-LNG与LNG性质 M-LNG与LNG在波长345 nm处波峰未发生明显偏移(见图3)，表明M-LNG未使LNG的性质发生明显改变。
图3 M-LNG与LNG光谱图
2.3 TSM性质 制备出的TSM呈透明状态(见图4)，质地较韧，具有弹性，放置于37 ℃恒温水浴箱中观察30 、60 、90 d后仍为透明状态，重量及体积无改变。制得的TSM重量为515 g，体积为500 mL，根据密度计算公式算出TSM密度为1.03 g/mL。
图4 透明硅胶体模
2.4 M-LNG标准曲线的建立 在波长为345 nm处测得不同浓度的M-LNG标准液吸光度符合曲线回归方程为：Y=0.3976x+0.0009，r2=0.9996(见图5)，可利用此曲线回归方程对待测样品中的M-LNG浓度进行计算。
图5 M-LNG浓度与吸光度的关系
2.5 M-LNG在TSM中的显色变化及随弥散距离变化的规律 将置入M-LNG的TSM放在37 ℃恒温水浴箱中30 、60、90 d后观察TSM呈黄色，且TSM腔最深，向外黄色逐渐变淡，每30天记录1次，能直观的反映出M-LNG的浓度在TSM中的呈递减变化(见图6)。第1组中A1、B1、C1、D1组各组所含M-LNG浓度呈逐渐下降趋势，符合线性回归方程：Y=-0.0247x+0.1136，r=0.9937；第2组中A2、B2、C2、D2组各组所含M-LNG浓度呈逐渐下降趋势，符合线性回归方程：Y=-0.0243x+0.1135，r=0.9918；第3组中A3、B3、C3、D3组各组所含M-LNG浓度呈逐渐下降趋势，符合线性回归方程：Y=-0.0243x+0.1125，r=0.9846。TSM放置30 、60、90 d时，A、B、C、D组间(弥散距离不同)M-LNG在TSM壁中的浓度随弥散距离增加而下降(P<0.01)，呈现出距离依赖的“浓度梯度”现象(见表1、图7)。
A：30d； B：60d ；C：90d。图6 加入M-LNG后TSM的颜色变化
表1 TSM放置30、60、90d后切片4组所含M-LNG浓度(mg/mL)情况(n=12)
分组30 d60 d90 dFP空白0.0000±0.00000.0000±0.00000.0000±0.0000A 0.0922±0.0078△0.0909±0.0051△0.0906±0.0075△ 0.2000.659B 0.0642±0.0037△ 0.0639±0.0034△ 0.0624±0.0033△1.1350.299C 0.0407±0.0028△0.0385±0.0038△0.0353±0.0030△2.0720.077D 0.0218±0.0013△0.0209±0.0027△ 0.0190±0.0027△0.3420.743F△349.1160503.4120378.7810P△0.00000.00000.0000
△:TSM放置30、60、90 d后，A、B、C、D组间M-LNG浓度比较，P<0.01。
图7 TSM放置30 d、60 d、90 d后，各组间M-LNG浓度比较
2.6 TSM中M-LNG浓度随时间变化的规律 TSM放置30 、60 、90 d时，A、B、C、D组内(弥散距离相同)，M-LNG浓度随放置时间延长稍有下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明在一定弥散距离内，TSM壁中M-LNG的浓度在一段时间内保持相对稳定，呈现出时间依赖的“浓度稳定”现象(见表1、图8)。
图8 TSM放置30、60、90 d后，各组内M-LNG浓度比较
2.7 TSM中M-LNG浓度递度的三维重建 本实验中制成的TSM的形状与真实人体子宫存在差别，特将各组所含M-LNG的浓度进行数据整合，由第三方杭州天迈模型科技有限公司进行三维重建(见图9)，能更好、更直观的反映出M-LNG在TSM壁中的浓度变化。
A:整体;B:剖面。图9 TSM三维重建
3 讨论
3.1 LNG的显色反应 氨基磺酸是一种白色结晶，又称为“固体硫酸”，但腐蚀性却很小，与皮肤长时间接触并无损害，氨基磺酸溶于水，微溶于有机溶剂中，不挥发、不吸湿、低毒、性质稳定[7]。异烟肼为无色结晶，或白色至类白色的结晶性粉末，易溶于水。LNG的母环为甾环，官能团有酮基、醇羟基及乙炔基，这些化学结构特征在一定条件下可被某些化学物质识别，用于LNG显色反应或鉴定。如甾环可与酸(硫酸、磷酸等)反应，显黄、橙或深红色；酮基可与羰基试剂(羟胺、苯肼、2，4-二硝基苯肼、异烟肼等)反应呈黄色；醇羟基能使高锰酸钾退色；乙炔基能与硝酸银生成白色沉淀等[8]。利用LNG相关基团与不同化学试剂间的特殊显色反应，就能对LNG及其含量进行间接的观察、测量。建立评价LNG浓度梯度TSM即是利用这样的原理，在TSM腔中，植入一定剂量含上述化学基团物质标记的LNG，通过观察彩色M-LNG在TSM的弥散，以色彩强弱的形式直观体现LNG在TSM中的浓度梯度变化。
3.2 M-LNG在TSM中的弥散规律 本实验结果表明，当TSM放置时间不变时，M-LNG的浓度在TSM中随着TSM壁的增厚，呈逐渐下降趋势，符合线性回归衰减规律，孙翠等[6]研究结果表明LNG的浓度在硅胶仿子宫体模中由体模中心向外逐渐较少，其衰减规律符合线性回归，本研究中M-LNG在TSM中的弥散规律与其研究的LNG在硅胶仿子宫体模中的弥散规律一致。M-LNG浓度在TSM壁中存在距离依赖的“浓度梯度”现象可能与M-LNG与甘油混合溶液中作为溶质的M-LNG的“简单扩散”和“溶质浓度差”有关。简单扩散是物质分子通过随机分子运动从高浓度区域向低浓度区域的网状传播，而物质浓度差是决定简单扩散效果的关键因素之一[9]。在不考虑其他因素的情况下，TSM腔中高浓度的M-LNG将会以“简单扩散”的形式向TSM壁中扩散，并在TSM壁中形成浓度由高至低的连续的“浓度梯度”。因此，TSM壁中M-LNG“浓度梯度”现象的本质是由溶质浓度差和简单扩散的特性决定。此外，M-LNG、甘油与硅胶三者之间是否会形成特殊的化学复合物结构，并对M-LNG的弥散效果产生影响还有待进一步研究。除“浓度梯度”现象外，研究还观察到M-LNG在TSM壁中存在时间依赖的“浓度稳定”现象，即在相同的弥散距离内，M-LNG可在较长时间保持相对稳定。分析原因可能在以下几方面：一方面，TSM的孔径可能很小，TSM的主要成份为硅胶，硅胶根据孔径大小分为大孔、小孔、微孔和纳米孔硅胶[10-11]，本实验TSM经扫描电子显微镜放大到2 000倍仍未观察到相应孔径，因此，推测TSM的孔径应为纳米级，从而导致M-LNG在TSM壁中的弥散过程非常缓慢；另一方面，硅胶具有一定的吸附能力[12-13]，可能对M-LNG具有一定吸附作用，并在TSM壁中形成小的“M-LNG储存库”，致使TSM壁中M-LNG浓度能在较长时间内保持相对稳定的状态。本研究的两个重要发现，即M-LNG在TSM壁中同时存在“浓度梯度”和“浓度稳定”的现象可以很好解释有关LNG-IUS治疗子宫腺肌病存在“病灶阈值”现象的学术观点[4-5]。“有效药物浓度”和“持续作用时间”是药物治疗疾病有效的两个重要因素[14-15]。本研究M-LNG呈现在TSM壁中“浓度梯度”现象提示：当TSM壁中M-LNG的浓度下降尚未到达“有效浓度”以下时，就能发挥其治疗作用；而“浓度稳定”现象则表明：一定范围内，TSM壁中的M-LNG浓度能在较长时间内保持稳定，使M-LNG可以持续较长时间发挥其作用。因此，当使用LNG-IUS治疗子宫腺肌病时，在一定子宫体积(或肌壁厚度)范围内LNG-IUS治疗有效，超过这个范围LNG-IUS将失去治疗作用。课题组的相关研究[4-5]将子宫腺肌病患者根据超声子宫肌壁厚度或腺肌瘤最大直径(Maximum diameter，MD)分为轻度、中度、重度3种程度，当MD<30 mm时，LNG-IUS对子宫腺肌病有治疗作用，表现为控制症状(痛经和经量过多)和逆转体征(缩小子宫体积和下调CA125)；当MD 为30～35 mm时，LNG-IUS能较好控制子宫腺肌病患者的痛经并减少月经量，但缩小子宫体积和下调CA125的作用不明显，远期有复发现象；当MD>35 mm时，单独使用LNG-IUS治疗子宫腺肌病无效。并筛选出了单纯使用LNG-IUS治疗子宫腺肌病的有效病灶阈值为MD≤35 mm(对应的子宫体积为V=140.5+35.4 mL)，推荐使用的最佳人群为：MD<30 mm(对应的子宫体积为：V=117.4±34.1 mL)。两年后， Lee等[16]的研究也发现，当子宫体积≥150 mL后，LNG-IUS的治疗效果明显下降，与我们的研究结果相似。本研究发现LNG在TSM壁中同时存在“浓度梯度”和“浓度稳定”现象，间接地为LNG-IUS用于治疗子宫腺肌病存在“病灶阈值”现象提供了实验佐证。
3.3 问题与展望 在本实验研究中，制作TSM的材料较为单一，且TSM毕竟不是生物软组织，不同于人体子宫组织，不具有活体子宫的血液循环特点，这些因素使得TSM与真实人体子宫存在较大的差异。然而，由于仿子宫体模的相关研究缺乏资料参考，无从借鉴与对比。因此，在未来的研究中，通过改进体模制作材料、方法与工艺，制作尽可能接近人类真实子宫质地和循环特点的仿子宫体模，用于宫内药物缓释系统的“动态研究”；此外，制作“标准”的透明仿子宫体模，探索可以不通过切开体模，而是采用分光测色计等仪器设备直接测定LNG在透明仿子宫体膜壁中的弥散规律，实现宫内药物缓释系统直观、快捷的“静态研究”，都是团队今后努力的方向。
综上所述，LNG可被氨基磺酸和异烟肼标记显黄色，这种化学标记并未明显改变LNG性质及在透明硅胶体模中的弥散规律。M-LNG在透明硅胶体模中弥散规律符合线性回归，并同时存在距离依赖的“浓度梯度”和时间依赖的“浓度稳定”现象，从实验上证明了左炔诺孕酮宫内缓释系统治疗子宫腺肌病存在“病灶阈值”现象的学术观点。
