王明阳，唐 颖，刘 芳，陈彩霞，石宝生，袁晓艳
(1 遵义医科大学 药学院分析化学教研室，贵州 遵义 563099)
中药钩藤为茜草科植物钩藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.exHavil.]、大叶钩藤(UncariamacrophyllaWall.)、毛钩藤(UncariahirsutaHavil.)、华钩藤[Uncariasinensis(Oliv.)Havil.]及无柄果钩藤(UncariasessilifructusRoxb.)的干燥带钩茎枝[1]。钩藤又名猫爪藤，以带钩的茎枝入药，对头痛眩晕、脑血管疾病和神经疾病有着很好的治疗效果[2]。在中国和日本，被用于清热、灭风寒、抗癫痫、安抚肝脏，并已有数千年的历史[3]。已报道的钩藤化学成分有100多种，包括生物碱类、黄酮类、三萜类和苷类等[4]。吲哚类生物碱是钩藤的主要有效成分，其中以钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱为主要药效成分[5]。然而，研究表明钩藤药材中钩藤碱含量较低[6]，故有效提取钩藤中总生物碱，从而提高中药钩藤的开发利用率，是目前需要解决的问题。本实验采用均匀设计法，以期获取最优的中药钩藤总生物碱的提取工艺条件。均匀设计是通过改进实验程序来优化提取工艺的最有效的实验设计[7-8]。该方法是近年来兴起的工艺优化方法，具有实验次数少、均匀分散、方便、迅速、准确的特点，可使实验点具有更好的代表性[9]。它尤其适用于建模和分析多因素实验，来阐明单一效应和互动效应是如何影响基于一系列统计技术的响应[10]。目前，均匀设计已广泛应用于食品化学、药学、材料科学等领域[11]。
本研究拟采用超声提取法对钩藤药材进行总生物碱提取，选用U6(64)均匀设计实验法，以钩藤总碱得率为指标，选取乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度为考察因素，优选钩藤总生物碱的提取工艺。同时建立HPLC对钩藤药材提取物中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱进行定性定量分析，为提高钩藤药材利用率及质量控制标准提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；FA2004N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)；RE-2000B型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-ⅢG型循环水式多用真空泵(郑州长城科技工贸有限公司)；79CS型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。对照品钩藤碱(批号 PRF8081601)、异钩藤碱(批号 PRF8102541)、去氢钩藤碱(批号 PRF18032803)、异去氢钩藤碱(批号 PR17062109)均购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，购自美国Tedia公司；水为超纯水；其余试剂均分析纯；实验用药材(产自云南)购自遵义芝林大药房，经遵义医科大学生药学教研室张玉金博士鉴定为钩藤带钩茎枝，以中药粉碎机粉碎后过60目筛，备用。
1.2 方法
1.2.1 钩藤总生物碱含量的测定
1.2.1.1 钩藤总生物碱的提取 精密称取钩藤药材粉末1.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加入70%乙醇40 mL，摇匀，浸泡过夜后，超声提取3次，滤过后合并提取液，减压浓缩得粗提取物，粗提取物加0.1%盐酸15 mL溶解，过滤，滤液用二氯甲烷试剂萃取3次，水层用氨水调节pH至10，再用二氯甲烷试剂萃取2次，对萃取液进行浓缩后加无水乙醇溶液稀释，定容至50 mL容量瓶，得总生物碱储备液。
1.2.1.2 线性关系的考察 精密称取钩藤碱对照品5.0 mg于50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并定容。精密量取钩藤碱对照品储备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别置于容量瓶中，加无水乙醇稀释至2 mL。本实验采用邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液-溴甲酚绿法[12]测定钩藤总生物碱含量。具体操作如下：向5个容量瓶中分别精密加入4 mL pH 3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液与4 mL溴甲酚绿溶液，振摇，静置30 min，精密加入2 mL二氯甲烷，充分振摇萃取，分取二氯甲烷层，反复萃取5次后合并二氯甲烷层溶液，将萃取液置于10 mL容量瓶定容，加无水硫酸钠1.0 g脱水0.5 h，滤过，在413 nm处测定吸光度，以钩藤碱对照品溶液浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.1.3 钩藤总生物碱含量的测定 精密量取钩藤总生物碱储备液1.0 mL，按“2.1.2”项下方法测定钩藤总生物碱溶液的吸光度(A)，将所得吸光度(A)代入标准曲线计算钩藤总生物碱含量，进而得到钩藤总生物碱得率，钩藤总生物碱得率计算公式如下：
式中：C为计算所得钩藤总生物碱浓度(g/mL)；V为钩藤总生物碱提取后定容的体积(mL)；m为称量的钩藤药材质量(g)。
1.2.1.4 钩藤总生物碱提取条件的优化 称取钩藤药材粉末约1.0 g，将乙醇体积分数(A)、超声时间(B)、液料比(C)、温度(D)确定为4个考察因素，每个因素设置6个水平，选用U6(64)计均匀设计实验表，以钩藤总生物碱得率为指标筛选最优化提取工艺，每个实验重复3次。实验安排见表1。
表1 均匀设计法四因素六水平表
1.2.2 4种钩藤生物碱类成分的定量分析
1.2.2.1 色谱条件 色谱柱为InertsilTMODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL。流动相为乙腈-0.1%三乙胺磷酸盐溶液(pH 7)，采用梯度洗脱(0～30 min，乙腈30%～40%；30～40 min，乙腈40%～95%；40～50 min，乙腈95%；50～51 min，乙腈95%～30%C；51～81 min，乙腈30%)。
1.2.2.2 4种生物碱标准曲线的绘制 精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱对照品各5.0 mg，分别置于4个5 mL的容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，即得各钩藤碱化合物对照品溶液。精密量取4种对照品溶液各1.0 mL，共同置于5 mL的容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度约为0.2 mg/mL的混合对照品液。取上述混合对照品溶液2.5 mL，依次稀释2倍，记作混标2、混标3、混标4、混标5，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样10 μL。以质量浓度(X)对峰面积积分值(Y)进行回归处理，得到钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的标准曲线。
1.2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取钩藤粉末10.0 g，置于500 mL量瓶中，按筛选出的最优化提取条件，提取3次，抽滤，合并3次滤液，得供试品溶液。
1.2.2.4 样品的含量测定 按照最优制备工艺提取钩藤总生物碱，再按“2.2.1”的色谱条件进样测定。
1.2.3 方法学考察
1.2.3.1 精密度实验 钩藤总生物碱含量测定过程中，精密吸取同一钩藤碱对照品储备液1 mL，按“2.1.2”项下邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液-溴甲酚绿法显色并测定吸光度，重复测定6次，计算吸光度的RSD值。对于钩藤生物碱类成分的HPLC定量分析实验，吸取钩藤混合对照品溶液10 μL，连续重复进样测定6次，测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的峰面积，计算各峰面积的RSD值。
1.2.3.2 稳定性实验 钩藤总生物碱含量测定实验中，精密量取同一钩藤碱对照品储备液1 mL，按“2.1.2”项下邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液-溴甲酚绿法显色，于室温放置0、0.25、0.5、0.75、1、1.5 h，测定各时间点的吸光度，计算吸光度的RSD值。HPLC法测定生物碱含量过程中，精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、6、8、16 h 进样10 μL，记录钩藤中各峰面积，计算峰面积的RSD值。
1.2.3.3 重复性实验 钩藤总生物碱含量测定实验中，精密称取同一批钩藤药材粉末6份，按筛选出的最优化提取工艺提取钩藤总碱，并按“2.1.3”项下方法计算钩藤总碱得率，计算总碱得率的RSD值。HPLC测定生物碱含量实验中，取同一批次的供试样品6份，精密称定， 按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计算各峰面积的RSD值。
1.2.3.4 加样回收率实验 钩藤总生物碱含量测定实验中，精密量取总生物碱储备液1.95、1.9、1.8 mL置于3个容量瓶中，分别加入钩藤碱对照品储备液0.05、0.1、0.2 mL，按“2.3.1.1”项下邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液-溴甲酚绿法显色并测定吸光度，计算平均回收率和RSD值。钩藤中4种生物碱HPLC测定含量实验中，精密称定同一批次的已知含量的钩藤药材粉末约1.0 g，6份，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算平均加样回收率。
2 结果
2.1 钩藤总生物碱含量的测定
2.1.1 总生物碱标准曲线的绘制 以钩藤碱浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：A=0.0203C+0.061 8，r=0.993 7，表明钩藤碱在0.036 7～0.081 9 mg/mL范围内线性关系良好。
2.1.2均匀设计法优化钩藤总生物碱的提取工艺 U6(64)均匀设计法提取钩藤总生物碱，通过计算表2得出结果y=1.260-0.012A-0.00012D2+0.000019AB，由此可以得到乙醇体积分数A、超声时间B及提取温度D对总生物碱含量影响最大，而液料比C对总生物碱含量影响较小。将A、B、D三个因素对钩藤总生物碱含量进行曲面响应分析，见图1。由图1可知，当乙醇体积分数不变时，总生物碱的提取率随着超声时间的增加而逐渐升高，在超声60 min时达到最大，说明超声时间越长提取率越高；当超声时间不变时，总生物碱的提取率随着乙醇体积分数的增加而逐渐降低，在乙醇体积分数40%时达到最大，说明乙醇体积分数越大越不利于总生物碱的提取；同理，当乙醇体积分数不变时，总生物碱的提取率随着提取温度的降低，逐渐升高，当提取温度为30℃时，总生物碱的提取率达到最高，随后逐渐降低，可能是由于高温下总生物碱不稳定，使其部分分解，从而导致提取率逐渐降低。故钩藤总生物碱最佳提取条件为：提取时间为1 h，乙醇体积分数为40%，温度为30 ℃，液料比为25∶1。在最佳提取条件下进行提取，总生物碱含量为0.40%。
表2 均匀设计法结果
图1 提取条件响应面图
2.2 4种钩藤生物碱类成分的定量分析
2.2.1 4种钩藤生物碱线性关系的考察 钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱所得回归方程及线性范围见表3，其分别在0.003 4～0.051 2 mg/mL、0.003 4～0.050 1 mg/mL、0.003 1～0.049 8 mg/mL、0.002 9～0.051 1 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
表3 回归方程与线性范围
2.2.2 4种钩藤生物碱类成分的HPLC含量测定 4种生物碱混合对照品溶液及钩藤供试品溶液的色谱图见图2。此条件下，色谱图基线平稳，钩藤中4种化学成分分离度良好，与相邻峰的分离度均>1.5。对均匀设计法中钩藤中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱含量进行测定，结果见表2，最优化提取条件下钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的含量得0.0671%、0.0351%、0.1054%、0.1280%。最优化条件下，总生物碱含量最高，钩藤中四种生物碱的总含量0.34%，占总钩藤碱含量的85%。
1：异去氢钩藤碱；2：去氢钩藤碱；3：异钩藤碱；4：钩藤碱。图2 混合对照品(A)和钩藤供试品(B)HPLC图谱
2.3 方法学验证
2.3.1 精密度实验 在钩藤总生物碱的含量测定实验中，吸光度的RSD值为0.37%(n=6)，表明仪器的精密度良好。同时，HPLC测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱实验中，峰面积的RSD值都在2.33%～2.79%(n=6)范围内，同样表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性实验 在钩藤总生物碱含量测定实验中，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5 h时所测得吸光度的RSD值为0.26%(n=6)，表明钩藤碱对照品储备液室温放置1.5 h稳定。同时，以HPLC于室温0、2，4 ，6，8，16 h时所测得四种钩藤生物碱峰面积的RSD值在2.61%～3.00%(n=6)范围内，表明处理后的供试品溶液室温放置16 h稳定。
2.3.3 重复性试验 按筛选出的最优化提取工艺分别对6份钩藤进行提取，钩藤总生物碱得率的RSD值为0.28%(n=6)，表明该方法的重复性良好。6份钩藤提取物中四种生物碱的RSD值在1.07%～1.85%(n=6)范围内，表明该方法重复性好。
2.3.4 加样回收率实验 在钩藤总生物碱含量测定的加样回收率实验中，平均回收率为88.2%，RSD值为0.15%，表明该方法的回收率良好。钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的平均加样回收率分别为88.7%、89.1%、90.2%、91.5%，表明回收率良好。
3 讨论
与其他统计方法相比，均匀设计法不仅减少了多维优化中的实验次数，而且能够使每个影响因素达到可能的影响极限[13]。均匀设计法是一种重要的统计方法，在许多优化过程中得到了成功应用[14]。因此本实验采用均匀设计法对钩藤总生物碱的超声提取工艺进行优化，通过影响钩藤中钩藤总生物碱得率的乙醇体积分数、提取时间、液料比、提取温度进行响应面实验，最终得到钩藤总生物碱最优化提取条件为：乙醇体积分数40%，提取时间1 h，液料比25：1，温度30℃。在该条件下对芝林大药房购买钩藤进行提取，得总生物碱得率为0.40%。均匀设计法减少了时间，节约了资源，为钩藤总生物碱的进一步开发和利用提供实验依据。
高效液相色谱条件尽可能将干扰物质与待测物分离开，流动相乙腈-0.1%三乙胺(磷酸盐调节pH 7)，进行梯度洗脱，峰形尖锐，分离度良好。在该色谱条件下，得钩藤中四种生物碱总含量为0.34%，占总生物碱含量的85%。本研究建立高效液相色谱法，测定中药钩藤中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱含量，方法简单，且具有良好的精密度、稳定性和重复性，为中药钩藤质量控制提供重要参考。
