陈玉姣 艾祥发 罗梦秋 李雪 窦雪娇 张红

(遵义医学院麻醉学系，贵州 遵义 563000)



七氟烷后处理减轻兔肺缺血再灌注损伤中AQP1的表达及意义研究

陈玉姣 艾祥发 罗梦秋 李雪 窦雪娇△张红

(遵义医学院麻醉学系，贵州 遵义 563000)

目的 探讨水通道蛋白1(aquaporin1，AQP1) mRNA在七氟烷后处理中对兔肺组织的作用。方法 选择新西兰大白兔12只，雌雄不拘，随机分为两组，每组6只：I组为肺缺血再灌注损伤模型组；S组为七氟烷后处理组。所有实验动物于阻断左肺门前(T1)、阻断左肺门60 min(T2)、实验结束时(T3)3个时间点分别检测肺组织AQP1mRNA表达及病理改变，实验结束时检测肺湿/干重比。结果 两组肺组织AQP1mRNA表达随时间推移逐渐下降；T3时点，S组AQP1mRNA表达高于I组，肺湿/干重比低于I组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 七氟烷后处理对肺缺血再灌注损伤有保护作用，可能与AQP1mRNA表达上调有关。

缺血再灌注损伤； 七氟烷； 水通道蛋白1

肺缺血再灌注损伤 (lung ischaemia-reperfu-sion injury,LIRI)常见于肺移植术、体外循环手术、肺栓塞溶栓治疗和休克等，可使患者产生肺动脉高压、肺水肿及呼吸衰竭，影响患者的住院时间和术后恢复，甚至导致死亡。探寻LIRI的发生机制和有效可行的防治方法，是近年人们研究的热点方向。本研究在LIRI后进行七氟烷后处理，观察其对肺组织AQP1mRNA表达的影响，旨在深入探讨LIRI的发生机制，为今后寻找有效可行的防治方法奠定实验基础。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验材料有：七氟烷(鲁南贝特制药有限公司)，RY-ⅡB麻醉工作站，金科威UT4000 Fpro有创监护仪，ABI 7900 qPCR仪，5804R型Eppendorf台式高速冷冻离心机，新西兰大白兔12只，雌雄不拘(遵义医学院实验动物中心提供)，随机分为两组：肺缺血再灌注损伤模型组(I组)、七氟烷后处理组(S组)。

1.2 实验方法 (1)动物模型制备：兔腹腔内均注射2.5﹪戊巴比妥钠25 mg/kg，仰卧位固定，气管插管后连接呼吸机，常规监测。维持潮气量12～15 mL/kg，呼吸频率16次/min，Ⅰ∶E=1∶2，FiO2∶99%。Ⅰ组分离左肺门，阻断左肺门60 min后开放左肺门60 min，实验结束；S组在开放左肺门的同时吹入2.2%七氟烷30 min，其余步骤与I组相同，后快速洗肺5 min，继续使用呼吸机维持呼吸25 min，实验结束。两组分别在阻断左肺门前、阻断左肺门60 min时、实验结束即阻断后又开放60 min时取左肺组织。(2)肺组织病理学检查：取左肺组织固定于10%福尔马林液中，脱水，石蜡包埋切片，HE染色，用光镜检测。(3)RT-PCR法检测兔肺组织AQP1mRNA的表达：用Trizol提取肺组织总RNA，用紫外分光光度仪测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，测RNA的纯度与浓度，反转录成cDNA后保存于-20 ℃待用，在PCR仪中行扩增反应。Rabbit-β-actin上游引物为5′-TGGCTCTAACAGTCC GCCTAG-3′，下游引物为5′-AGTGCGACGTGGA CATCCG-3′，Rabbit-AQP1上游引物为5′-CTAC ACTGGCTGTGGCATTA-3′，下游引物为5′-GCC AGGATAAAGTCGTAGATGAG-3′，退火温度65 ℃，40个循环，试剂盒及引物由大连Takara生物工程公司提供。(4)肺组织湿/干重比测定：实验结束时取兔左肺组织用滤纸吸干表面水分，分析天平秤湿重后，60 ℃烤箱中放置72 h秤干重，计算湿/干重比。

2 结 果

2.1 一般情况比较 两组兔子的体质量、雌雄构成等差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肺组织AQP1mRNA表达的变化 两组T1时间点肺组织AQP1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；随着时间推移，两组AQP1mRNA表达逐渐降低，I组T3时点降低更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；S组与I组比较，T3时点S组肺组织AQP1mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肺组织AQP1 mRNA表达的比较

注：同组间与T1比较时，*P<0.05；同组间与T2比较时，□P<0.05；同时点与Ⅰ组比较时，△P<0.05

2.3 肺湿/干重比的变化 实验结束时S组湿/干重比(4.3±0.4)明显低于Ⅰ组(5.6±0.2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 肺组织HE染色病理形态学比较 两组患者T1时间点肺组织结构完整，未见炎症细胞浸润，见图1。T3时间点I组的肺组织结构紊乱，肺间质明显增宽，肺泡腔内充满大量水肿液，见红细胞渗出，见图2；S组肺组织结构基本清晰，肺间质增宽，肺泡腔内有少量水肿液，见炎性细胞及红细胞浸润，见图3。

图1 I组T1时点肺组织(HE染色×400)

图2 I组T3时点肺组织(HE染色×400)

图3 S组T3时点肺组织(HE染色×400)

3 讨 论

LIRI[1]是指缺血的组织细胞恢复灌注后不但不能迅速恢复正常的代谢机能，反而加重其损伤，主要表现为再灌注组织充血、水肿。研究[2]表明，在肺移植手术后1 h，导致患者死亡的主要原因就是LIRI导致的肺功能障碍，因此研究减轻LIRI的措施十分重要。

近年来，由于七氟烷诱导快、苏醒迅速、刺激小等优点而被广泛用于临床,研究表明七氟烷可明显减轻患者开胸手术行单肺通气时肺部炎症因子白介素6、8、10及C反应蛋白等的表达[3]；也可降低脂多糖导致的肺部炎症反应[4]。大鼠肺缺血再灌注模型中，张素晶等[5]研究表明，七氟烷(呼气末浓度为2.1%)后处理持续30 min，可减轻大鼠LIRI，可能与降低肺组织炎性反应，抑制细胞凋亡有关。同时Jun[6]也报道，2.2%七氟烷吸入可改善大鼠肺血管通透性，从而减轻LIRI。本实验研究结果显示：两组T3时点较T1时点，兔肺组织湿/干重比均升高，光镜示肺间质明显增宽，肺泡腔内大量水肿液，说明兔肺缺血再灌注后肺水肿加重；但S组较I组T3时点肺湿/干重比降低，肺泡腔内水肿液有所减少，说明七氟烷后处理可以明显改善兔LIRI导致的肺水肿。在临床中，肺缺血时机常常难以掌控，而药物后处理是当肺组织缺血后，行再灌注前或再灌注即刻使用药物进行干预的方法，故后处理相较预处理具有更强的临床可操作性。

AQP1属于水通道蛋白家族的成员之一，主要分布于肺微血管内皮的质膜、支气管周围血管床、气管粘膜上皮、淋巴管和胸膜以及肺泡Ⅱ型上皮细胞，主要负责清除支气管和脉管周围组织内的水分[7]，参与调节内皮细胞通透性和屏障功能[8]。在犬体外循环中应用乙酰唑胺，AQP1表达下调，肺水明显增加，Pa O2和RI升高，OI降低，肺损伤加重[9]。而对体外循环犬肺组织进行缺血后处理，AQP1表达上调，肺损伤减轻[10]。在生理条件下，AQP1参与构成血气屏障气体侧的水分子通路。对维持血管与间质之间的水运动平衡意义重大。在肺缺血再灌注期间，光镜下可见肺不张伴不同程度肺气肿，肺间质增宽、水肿，炎细胞浸润，肺泡内较多红细胞渗出[11]，此时伴有水转运的紊乱，AQP1数量、分布、功能等的改变。本实验研究结果显示，两组T2、3时点AQP1mRNA表达均明显低于T1时点，T3时点湿/干重比升高并可见肺间质明显增宽，肺泡腔内大量水肿液，说明兔LIRI后AQP1mRNA减少时肺水转运发生障碍，肺水肿加重；但S组较I组T3时点AQP1mRNA表达升高，湿/干重比降低，肺间质稍增宽，肺泡腔内水肿液有所减少，说明兔LIRI后使用七氟烷AQP1mRNA表达增高，肺水肿减轻，提示七氟烷可能通过上调AQP1mRNA的表达，改善肺水肿，减轻肺损伤。

综上所述，七氟烷作为一种新型的吸入麻醉药，可能通过上调AQP1mRNA的表达，改善肺水肿，减轻兔肺缺血再灌注损伤。

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Role of aquaporin 1 reducing lung ischemia-reperfusion injury by sevoflurane post-treatment in rabbits

ChenYujiao,AiXiangfa,LuoMengqiu,LiXue,DouXuejiao,ZhangHong.

DepartmentofAnesthesioIogy,ZunyiMedicaICollege,Zunyi563003,Guizhou,China.Correspondingauthor:DouXue-jiao,Email:douxuejiao-0603@163.com.

ObjectiveTo evaluate the role of aquaporin 1 (AQP1) mRNA expression by sevoflurane post-treatment in rabbits lung.Methods Twelve healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 2 group (n=6 each) which were lung ischemia-reperfusion group (group I),sevoflurane post-treatment (group S).The lung tissues were obtained for determination of AQP1mRNA and microscopic examination at before blocked the left lung,at blocked the left lung 60 min and at the end of the experiments (T1-3).Lung tissues were gathered to determine the wet/ dry weight ratio ( W/ D).Results Compared with group T1,both of two groups AQP1mRNA expression was down-regulated at T2,3.The expression of AQP1mRNA group S was higher than group Ⅰ at T3,but lung W/ D was contrary (P<0.05).Conclusion sevoflurane post-treatment increases the expression of AQP1mRNA,provides a protective effect on lung suffering from ischemia-reperfusion injury in rabbits.

Ischemia-reperfusion injury； Sevoflurane； AQP1

大学生创新创业训练计划项目(1.贵州省201410661004；2.遵义医学院院发[2013]6505)

R-332;R641

A

1000-744X(2016)12-1246-03

2016-10-23)

△通信作者，E-mail:douxuejiao0603@163.com