百草枯引起大鼠肺纤维化研究进展

杨珣 饶珊珊 张湘燕,3△

1.遵义医科大学研究生院,贵州 遵义 553000；2.贵州省人民医院呼吸与危重症医学科,贵州 贵阳 550002；3.贵州大学医学院,贵州 贵阳 550025)

百草枯(PQ)作为一种有效的除草剂,已广泛应用于农田和牧场,具有显着的除草效果。百草枯化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐,对人体有很强的毒性[1],特别是在口服中毒情况下,由于无有效的治疗手段,死亡率高达90%[2]。临床病例显示,PQ可导致多个器官损伤,特别是肺损伤,PQ可引起肺泡上皮损伤甚至死亡,随着肺泡细胞的破坏,进一步出现肺毛细血管破裂导致肺泡内出血和肺部感染,最后发生肺纤维化[3]。目前PQ引起死亡的机制已初步阐明,但是 PQ引起肺纤维化的机制并没有澄清。利用大鼠建立百草枯模型稳定可靠,比较符合百草枯致人肺纤维化病理特点。我们综述了百草枯致大鼠肺纤维化的研究现状,以期对为阐明百草枯致肺纤维化的发病机制提供参考,并为后续治疗提供方向。

1 百草枯致大鼠肺纤维化发病机制

1.1肺泡损伤 大量实验[4-6]显示,按照百草枯15 mg/Kg剂量进行大鼠肺纤维化模型构建,效果较好,观察PQ染毒大鼠肺组织病理变化,发现肺纤维化的发生主要有3个环节:肺泡的免疫和炎症反应—肺实质损伤—受损肺泡修复和纤维化。许多肺部疾病均可导致肺纤维化重塑,肺损伤的起源尚不清楚,但肺泡上皮II型(AE2)细胞在肺纤维化中起着关键作用,它们对上皮细胞再生、肺泡稳定和与成纤维细胞相互作用有重要影响,而这些被认为是胶原沉积的原因,最终引起肺泡上皮持续损伤、再生能力受损、肺泡塌陷,导致肺纤维化[7]。

1.2氧化损伤 百草枯中毒造成的肺损伤主要与活性氧、过度脂质过氧化反应所产生的脂质过氧化氢物及谷胱甘肽含量减少有关。百草枯中毒时,百草枯与NAD(P)H在NAD(P)H氧化酶作用下,生成百草枯基团和NAD(P)+,同时氧被还原成超氧阴离子。肺上皮细胞胞浆中具有较多的对二苯基敏感的NAD(P)H:百草枯氧化还原酶,此酶在NAD(P)H存在情况下,利用氧,生成百草枯亚基团,导致肺损伤。在细胞中提取的百草枯还原酶包含硫氧还原蛋白还原酶的活性,可以保护细胞不受氧化应激损伤[8]。提示氧化损伤是引起肺损伤致肺纤维化的重要因素。既往研究发现[9]：在大鼠百草枯中毒中,肺组织和BALF中的丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(HYP)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平都升高,SOD和GSH-PX活性降低；肺组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-1 mRNA也升高。其他研究也发现,百草枯中毒大鼠血清新喋呤水平与LDH活性、肺丙二醛、TGF-β1及肺损伤程度相关,再次证实氧化应激、抗氧化能力降低和炎症在百草枯诱导的肺损伤中起到重要作用,同时提示新喋呤水平升高程度可能成为百草枯中毒的一个预后评估参数[10]。实验证明PQ中毒后2h内TSP-1、CD 47表达与肺组织中活性氧(ROS)、羟自由基、丙二醛及肺泡炎症程度呈正相关,PQ中毒后1d TSP-1、CD 47表达与肺组织羟脯氨酸浓度呈正相关,提示TSP-1和CD 47的表达与氧化应激有关,进而导致大鼠肺泡炎及肺纤维化的发生发展[11]。

1.3内质网应激 研究发现百草枯暴露于体外和体内,会导致线粒体DNA(mtDNA)损伤及线粒体功能障碍,mtDNA以无碱性位点的形式受损,受损原因与氧化损伤相关[12]。有研究[5]发现,百草枯中毒大鼠肺组织α-SMA、糖原相关蛋白78(GRP78)表达上调,提示内质网应激在百草枯中毒大鼠肺纤维化中起到重要作用。尽管哺乳动物细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡(未折叠蛋白反应)有防御机制,但百草枯中毒改变了未折叠蛋白相关分子的表达水平,导致在人肺上皮A549细胞中发生内质网应激相关细胞死亡,而牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)能够减轻百草枯诱导的内质网应激而抑制细胞死亡,减轻肺损伤[13]。

1.4信号通路 PQ染毒的大鼠肺组织中TGF-β1明显升高,研究已经表明TGF-β1/Smads 信号通路的激活在PQ 引起的肺纤维化发病中具有十分重要的作用[14]。除此之外,上皮间充质转换(EMT)被认为参与了百草枯(PQ)诱导的肺纤维化过程,但这一过程的分子机制尚未明确。研究发现PQ诱导的上皮RLE-6NT细胞发育间充质细胞特征,上皮标记物E-cadherin显着减少,细胞外基质标记物α-平滑肌肌动蛋白呈剂量和时间依赖性增加。此外,PQ处理的RLE-6NT细胞具有EMT样表型,MMP-2、MMP-9、COL I和COLⅢ表达增高,迁移能力增强,这些都导致肺纤维化的发生,而PQ诱导的EMT通过激活MAPK通路导致erk-1和smad2磷酸化,表明PQ诱导的肺纤维化是通过由MAPK途径介导EMT发生的。MAPK通路可能是肺纤维化发生的原因,且是肺泡上皮细胞的一个有前途的治疗靶点[15]。

1.5其他细胞因子 PQ染毒大鼠中,结缔组织生长因子(CTGF)表达增加, CTGF是一种重要的生长因子,参与组织修复和纤维化的发生,可以触发肺成纤维细胞的增殖、迁移,诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,引起α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原的表达增加,提示 CTGF可能在PQ诱导的肺纤维化中起重要作用[16]。同样观察到在随PQ中毒大鼠肺纤维化进程中,整合素连接激酶(ILK) 的mRNA和蛋白表达增加,ILK在肺纤维化形成中可能起着重要作用[17]。上述研究提示CTGF、ILK可能是PQ中毒致肺纤维化的关键分子靶点。

2 抗纤维化治疗进展：

2.1血管紧张素II的抑制 氯沙坦是一种血管紧张素II 1型受体拮抗剂,对纤维化的治疗有积极作用。有实验探究了氯沙坦对PQ中毒大鼠肺纤维化的影响,发现氯沙坦能显着降低PQ染毒鼠肺组织中羟脯氨酸含量和下调TGF-β1、MMP9和TIMP-1的mRNA和I型和III型胶原的表达。PQ组大鼠的组织学检查显示肺损伤和肺泡间隙广泛的炎性细胞浸润和肺纤维化,而氯沙坦可明显减轻这种损伤并预防肺纤维化。结果表明,氯沙坦能减轻肺损伤,预防肺纤维化[18]。而这种抗纤维化作用可能是因为血管紧张素II的抑制[19]。以往的研究[20]表明,从中药丹参中分离得到的活性化合物丹参酮IIA (TiIA)能有效地减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化,然而,Tiia是否能减轻百草枯(PQ)所致的急性肺损伤(ALI)尚未确定。PQ可引起BALF组织学改变,增加中性粒细胞浸润、肺湿/干重比、细胞总数、蛋白含量和LDH水平,同时显着降低肺组织ACE 2和Ang-(1-7)的表达水平,研究表明 Tiia减弱了这些作用,提示Tiia可能对PQ诱导的大鼠ALI有治疗作用,ACE 2和Ang-(1-7)可能参与了这种作用的机制。

2.2过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPAR-γ) PPAR-γ是一类配体激活的核转录因子超家族成员,在炎症的发生中有着重要的调节作用。罗格列酮是一种PPAR-γ激动剂,能恢复PQ引起的动脉血氧分压(PaO 2)下降、湿干(W/D)肺组织重量比(W/D)升高和肺纤维化评分,抑制PQ诱导的PPAR-γ和α-SMA蛋白和mRNA水平的降低。提示罗格列酮通过上调PTEN和下调转化生长因子-β1的表达,以PPAR-γ依赖的方式减轻PQ诱导的肺纤维化[21]。阿托伐他汀是一种PPAR-γ受体拮抗剂,除具有降胆固醇作用外,还具有抗炎和抗氧化的作用。有学者使用阿托伐他汀治疗百草枯染毒的大鼠,测定血清丙二醛(Lung hydroxyproline)和肺指数及半定量组织病理学变化。发现阿托伐他汀对百草枯诱导的大鼠肺纤维化有良好的预防作用,而它同样通过拮抗PPAR-γ降低TGF-β1表达水平,从而在百草枯中毒中起到了的抗纤维化作用[22]。以上研究提示PPAR-γ的研究可能为治疗肺纤维化带来新的方向,其机制可能与PPAR-γ拮抗剂拮抗TGF-β1的表达有关。

2.3中药抗炎、抗氧化治疗 百草枯致肺纤维化暂无有效治疗方法,其中中药治疗是目前一种治疗手段。已证明依达拉奉可通过抗氧化的方式减轻肺纤维化,研究者对比了银杏叶二萜注射液(DGMI)和依达拉奉对百草枯(PQ)所致大鼠肺损伤和肺纤维化的影响。结果发现DGMI可以降低PQ中毒大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,逆转肺组织中丙二醛(MDA)水平的升高和超氧化物歧化酶(SOD)水平的下降,显着提高PQ中毒大鼠的存活率,治疗效果更好[23]。黄芪总黄酮(FAC)也可以改善血清中的抗氧化酶活性,减轻纤维化程度和纤维化程度。FAC可能是通过抑制TGF-β/SMAD信号通路减轻了PQ诱导的大鼠肺纤维化[24]。姜黄素为二酮类化合物,具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用,有研究者使用姜黄素治疗百草枯染毒的大鼠,发现治疗组大鼠PaCO 2、血清Smad 4、Smurf 2和IL-4均低于百草枯组,证明姜黄素能减少PQ中毒大鼠肺组织胶原纤维沉积,有效改善百草枯中毒大鼠的肺纤维化[25-26]。也有研究发现七叶皂甙钠[27]、冬虫夏草[28]可通过抗炎作用减轻肺损伤。

2.4苯丙胺类兴奋剂 苯丙胺类兴奋剂可减轻PQ中毒所致的肺损伤和肺纤维化。这种效应是剂量依赖性的。ATS治疗可通过增加上皮标记物E-cadherin和ZO-1的水平,降低肺组织和体外细胞培养中间充质标记物α、SMA和波形蛋白的表达而减轻EMT的发生。此外,苯丙胺类药物在体内和体外还可能降低HIF-1α和β-catenin的水平。因此苯丙胺类兴奋剂可减轻PQ诱导的肺纤维化的机制可能与下调缺氧缺血性脑病(HIF-1)α/β-catenin通路和抑制苯丙胺类兴奋剂(ATS)诱导的EMT有关,苯丙胺类兴奋剂可作为治疗PQ中毒所致肺纤维化的药物[29]。

2.5亚氧苯胺羟肟酸(Saha) 最近的研究表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂亚氧苯胺羟肟酸(Saha)具有抗纤维化作用。但其抗纤维化的确切机制尚不清楚。我国学者发现SAHA通过抑制TGF-β1诱导的HDAC1活性来阻止Smad7的去乙酰化,提高Smad7蛋白水平,加强Smad7 TGF-β1/Smads信号通路的负调控作用,从而发挥抗纤维化作用[14]。

2.6吡非尼酮和强的松 吡非尼酮可减轻PQ诱导的肺纤维化,经过吡非尼酮治疗的PQ染毒大鼠肺组织羟脯氨酸含量、转化生长因子-β1和肿瘤坏死因子-α水平减低,吡非尼酮还能抑制PQ诱导的MMP-2和TIMP-1的增加,提示吡非尼酮通过调节大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸含量、氧化应激、促炎、促纤维化基因表达发挥抗纤维化作用。有意思的是,该实验对比了强的松的治疗效果,发现单用强的松并无抗纤维化作用,而当吡非尼酮与强的松龙合用时,所有上述的这些作用都被夸大了,表现出更强的治疗作用[30]。

3 结 语

百草枯中毒致肺纤维化的发病机制目前尚未阐明,但经过众多研究者努力,已取得了部分进展,用大鼠建模用于实验是较为广泛、可靠的方法,在此基础上,出现了许多新的百草枯致肺纤维化的治疗方向,但仍处于实验阶段,无突破性进展。然而百草枯农药中毒导致肺纤维化是临床常见病例,预后差,是目前研究的难点、重点,还需要大量研究者继续努力探索解决。