方 斌，杜晓伟，赵 丽，郭泽灵，李新宇，赵伟栋，钟海舰

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院2020级硕士研究生；3.赣南医学院2021级硕士研究生；4.赣南医学院医学信息工程学院；5.江西省医用组织工程材料与生物制造重点实验室；6.心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

葡萄糖作为活细胞能量来源和新陈代谢的中间产物，其浓度在人体血液中处于动态平衡［1］。当人体血糖代谢紊乱时会出现一系列疾病，例如糖尿病、低血糖症等。对于糖尿病患者而言，定期检测血糖浓度是掌控疾病情况的有效方式［2］。目前，血糖浓度的检测主要采用葡萄糖传感器来实现，根据其工作原理通常可分为热传感器［3］、光学传感器［4］、电化学传感器［5］、声学传感器［6］和磁性传感器［7］等；根据传感器识别元件的不同又可分为基于生物物质的葡萄糖传感器［如葡萄糖氧化酶［8-9］、葡萄糖脱氢酶［10］、刀豆蛋白A（Concanavalin A，Con A）［11］等］和非生物物质的葡萄糖传感器（如利用贵重金属［12-13］、过渡金属［14］、金属氧化物［15］、金属纳米颗粒［16-17］、碳基材料［18-19］、金属-有机框架材料［20］及肖特基结［21］等）。基于石墨烯/半导体肖特基异质结的葡萄糖传感器是一种新型的生物传感器，肖特基异质结构有助于进一步提高传感性能，包括线性检测范围、最低检出限等［22］。目前已有将石墨烯和半导体材料构成的肖特基异质结用于葡萄糖检测的研究报道，例如SKAR M A 等［21］利用石墨烯、氧化铂（PtO）和硅（Si）构建了石墨烯/PtO/Si 的肖特基异质结进行葡萄糖传感研究，结果表明，该结构具有高葡萄糖选择性，同时可实现宽线性范围和低浓度检测限。

目前将石墨烯等碳基材料和半导体材料构建的异质结用于葡萄糖传感主要基于半导体的电催化特性，通过催化葡萄糖氧化反应来检测葡萄糖浓度。例如KANG X H 等［23］利用石墨烯构建了葡萄糖氧化酶/石墨烯/壳聚糖纳米复合膜葡萄糖生物传感器，LIU J Y 等［24］利用二茂铁接枝可控壳聚糖/单壁碳纳米管/葡萄糖氧化酶/石墨烯（Fc-CS/SWNTs/GOD/Gr）结构制备了一种酶基葡萄糖传感器，实现了大范围、低检出限和快速响应的葡萄糖检测。但电催化方法借助电化学工作站通过循环伏安法或计时电流法来实现葡萄糖传感，电极制备过程较复杂，并多数需要在碱性环境下工作［25-26］，因此，不能很好地兼容人体pH环境（7.35～7.45）。

氮化镓（GaN）半导体由于具备宽禁带、高电子浓度、化学性质稳定、无毒、生物相容性好等特性［27］，被广泛用于传感器领域［13，28-31］。利用GaN构建的传感器主要有辐射传感器、机械传感器、生物传感器、化学传感器等。目前，已有少量GaN 基葡萄糖传感器的研究报道［31］，例如LIU J 等［32］使用GaN构建的高电子迁移率晶体管（High electron mobility transistor，HEMTs）结构实现了高灵敏度的葡萄糖检测。他们将3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）与GaN 表面对齐，再将金纳米颗粒（AuNPs）组装在APTES 表面，最后葡萄糖氧化酶通过静电吸附固定在APTES/AuNPs 功能化栅极表面实现葡萄糖浓度的检测。VARGHESE A 等［33］制备了一种多层结构AlGaN/AlN/GaN MOS HEMT，这种结构可用于多种生物物质的检测，灵敏度可高达0.054 mA·（μg·mL）-1。此外，GaN晶体具备独特的六边形晶格结构，该结构使其很容易和石墨烯结合［34-35］。

本研究提出利用石墨烯和GaN 半导体材料形成的肖特基异质结界面进行葡萄糖传感。石墨烯/GaN肖特基结作为一种新型的肖特基葡萄糖传感结构，通过测量异质结在不同葡萄糖浓度下电流-电压（I-V）曲线中的开启电压，获得葡萄糖浓度-开启电压标准曲线，从而实现葡萄糖传感。该测量方法简单，电极易于制备，无需在碱性环境进行。其具体传感原理为：石墨烯与GaN 接触可形成肖特基异质结，该异质结具有稳定的界面势垒和开启电压，开启电压可通过测量结间的I-V曲线获得。由于葡萄糖溶液是绝缘体，因此，当同一体积不同浓度的葡萄糖覆盖到界面表面后，会在表面上形成一层极薄的葡萄糖分子层，当在界面表面施加一定的偏压时，电子以隧穿的方式通过葡萄糖分子层，这将影响石墨烯/GaN 的界面势垒，从而影响界面的开启电压。不同浓度的葡萄糖溶液干燥后在石墨烯表面形成的晶体厚度和致密程度不同，所导致的开启电压也不同。通过研究开启电压和葡萄糖浓度的关系，即可获得葡萄糖在石墨烯/氮化镓肖特基异质结界面的传感特性。

1 材料与方法

1.1 设备和试剂电流-电压（I-V）测试采用搭配Keithley DMM6500 源表的探针台，氮化镓（极性，苏州纳维科技有限公司），石墨烯（铜基底单层，南京吉仓公司），200 g·L-1葡萄糖溶液（武汉普诺赛生命科技有限公司），铅标准溶液（100 μg·m L-1溶于1%HNO3溶液）、Con A、蔗糖、D-木糖、D-果糖、D-（+）-半乳糖、D-（+）-甘露糖、无水氯化锰、无水氯化钙、Tris-HCL 缓冲溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），L-谷氨酸、尿酸（上海麦克林生化科技有限公司），甘氨酸（北京索莱宝科技有限公司），L-抗坏血酸（西陇科学股份有限公司），去离子水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）产自Milli-Q 纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 实验方法石墨烯/GaN 肖特基异质结葡萄糖传感器结构及I-V测量方法如图1所示。首先通过转移工艺将单层石墨烯转移到GaN 表面，构建石墨烯/GaN肖特基异质结；其次，将10 μL不同浓度葡萄糖溶液滴至石墨烯表面并干燥（60 ℃，30 min）；最后，利用探针台，将一根尖端带有直径1 mm 铟球的金属钨针尖放置于葡萄糖中心区域，将另一根同样尖端带有直径1 mm 铟球的金属钨针尖放置于GaN表面的欧姆接触电极（Ohmic electrode）上，随后在两探针间施加线性电压（-1.0～1.0 V），同时采集电流信号，绘制出I-V曲线。

图1 石墨烯/氮化镓接触界面的I-V特性测量方法示意图

1.3 样品制备⑴将铜基单层石墨烯置于匀胶机的样品台上，吸取20 μL 聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl methacrylate，PMMA）苯甲醚溶液（wt%为6%）滴加至石墨烯中心，启动匀胶机，使得PMMA苯甲醚溶液均匀的旋涂在石墨烯表面，旋涂结束后自然晾干；⑵晾干后将PMMA/石墨烯/Cu 置于浓度为0.15 mM 的过硫酸钾刻蚀液中刻蚀铜；⑶铜完全被刻蚀后，用去离子水反复清洗PMMA/石墨烯；⑷彻底清洗后，将GaN 把PMMA/石墨烯盛出，并自然晾干；⑸晾干后，将PMMA/石墨烯/GaN 样品置于恒温焊台上，温度为100 ℃，加热30 min；待样品自然冷却后，浸入冷丙酮中10 min，去除PMMA，然后再将样品浸入约50 ℃热丙酮中30 min，浸泡3次，深度去除PMMA；最后用超纯水冲洗样品10 min，去除丙酮；⑹石墨烯/GaN 退火工艺：将样品置于退火炉中，温度为500 ℃，时间为2 h。退火结束后即完成石墨烯/GaN样品的制备。

2 结果和讨论

2.1 葡萄糖传感性能研究不同浓度葡萄糖溶液的I-V 特性如图2所示，由图可知开启电压（I-V曲线中电流为0.05 mA 时所对应的电压）随着葡萄糖浓度的增加而增大。图3则为开启电压-浓度图，通过线性拟合，可得到传感标准曲线方程为U=0.223 63+1.899 68×10-4C。由此可知，传感器的开启电压在葡萄糖浓度为1～1 000 μM 范围内成线性变化，灵敏度（即拟合直线的斜率）为189.968 V·M-1。在线性范围内选取浓度为250 μM、550 μM 和850 μM 的葡萄糖溶液进行验证性实验，结果表明，3 个浓度开启电压的实验测量值和从标准曲线上获得的理论值误差分别为0.46%、0.63%和1.25%。根据国际纯粹与应用化学联合会对检出限的规定，检出限的计算公式如下：CL=KSb/m，其中Sb为空白标准偏差，m 为分析标准曲线在低浓度范围内的斜率，K 为与置信浓度有关的常数（在本研究中K 取3）。利用该公式可计算出传感器的最低检出限为0.33 μM。

图2 不同葡萄糖浓度对应的I-V图

图3 不同葡萄糖浓度及对应的开启电压二者之间的线性拟合图

2.2 重复性和储存稳定性将同一浓度葡萄糖溶液用于同一石墨烯/GaN样品进行多次实验，以验证样品测量结果的重复性。所选择葡萄糖浓度为100 μM，重复次数为7次，将7组数据进行线性拟合如图4所示，7组实验计算得到的平均开启电压值为0.238 V，相对标准差为2.89%。将该传感器清洗干净在室温下放置15 天后，再次用于100 μM 的葡萄糖溶液检测，得到的实验值为0.240 V，结果表明，石墨烯/GaN肖特基异质结传感器具有优异的重复性和储存稳定性。

图4 石墨烯/氮化镓传感器在葡萄糖浓度为100 μM的7次重复实验的I-V图

2.3 通用性为验证该传感器的通用性，采用相同方法对不同浓度的重金属铅溶液和谷氨酸溶液分别进行了检测。众所周知，铅属于重金属，当人体内血铅含量超过一定阈值（100 μg·L-1）时会导致DNA 损伤、脂质过氧化和蛋白质巯基耗竭等［36-37］。谷氨酸则是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质之一［38］，在高浓度情况下表现出兴奋毒性，这与多种神经疾病有关，例如缺血性中风、癫痫和神经退行性疾病等［39］。因此，检测铅和谷氨酸含量具有重要的医学意义，也是生物传感领域的研究热点。

在重金属铅传感研究中，所配制的铅溶液浓度分别为100 μM、200 μM、300 μM、400 μM 和480 μM。图5（a）是5 组不同浓度铅溶液的I-V曲线和开启电压-浓度数据线性拟合结果，传感标准曲线方程为U=0.089 84+4.288 77×10-4C，相关系数为0.998 74。谷氨酸传感研究所采用的谷氨酸溶液浓度分别为100 μM、200 μM、300 μM、400 μM 和500 μM，图5（b）是5组不同浓度谷氨酸溶液的I-V曲线和开启电压-浓度数据线性拟合结果，传感标准曲线方程为U=0.232 00-2.449 51×10-4C，相关系数为0.982 56。

图5 不同溶液浓度对应的I-V图

铅溶液及谷氨酸溶液研究结果表明，两种物质的浓度均可与开启电压呈线性关系，说明石墨烯/GaN 肖特基异质结传感器具有通用性，能用于不同物质的检测。

2.4 选择性由以上研究结果可知，不同物质对应不同的传感标准曲线，说明不同物质对肖特基异质结的开启电压影响不同。因此，当石墨烯表面存在多种物质时，所获得的I-V曲线必然是多种物质的综合影响，无法选择性地区分其中某一物质的浓度。例如，在分析血液样本中的葡萄糖浓度时，血液中的其他干扰物质（包括甘氨酸、尿酸、L-抗坏血酸等）将会影响葡萄糖浓度的测定。为了优化石墨烯/GaN肖特基异质结传感器的性能，我们利用Con A修饰石墨烯表面实现了葡萄糖的选择性检测。Con A是一种在杰克豆中发现的典型凝集素蛋白。在生理条件下，Con A 以四聚体蛋白的形式存在，分子量为104 000，四个亚基中的每一个都有一个甘露糖或葡萄糖特异性结合位点。Con A 特异性结合葡萄糖的能力已被广泛用于设计使用各种信号转导机制的葡萄糖传感器，包括电化学［40］、机械［41］和光学［42-46］葡萄糖传感器。

在传感器选择性的研究中，采用的葡萄糖浓度是0.5 mM，其他干扰物质浓度为0.05 mM，二者浓度相差10倍，其主要原因是在真实的血液环境中葡萄糖浓度远高于其他干扰物质（10 倍以上）［47-49］。实验方法和过程如下：（1）将20 μL Con A溶液（0.5 mg·mL-1，其中含有1 mM MnCl2和1 mM CaCl2的0.1 M pH7.4 Tris-HCl 缓冲液）滴加至样品表面孵育30 min；（2）4 mL 超纯水冲洗，去除吸附较弱的Con A 分子；（3）将10 μL 的浓度为0.5 mM 的葡萄糖溶液，或葡萄糖和其他干扰物质的混合溶液（其中葡萄糖溶液浓度均为0.5 mM，干扰物质的浓度均为0.05 mM），或0.6 mM 浓度的葡萄糖和其他干扰物质（浓度为0.05 mM）的混合溶液滴加至石墨烯表面，随后在4 ℃环境下孵育30 min；（4）利用4 mL的超纯水清洗样品表面，以去除未连接Con A 的葡萄糖分子；（5）在4 ℃环境下干燥后进行I-V曲线测量。由葡萄糖溶液无干扰物质和加入不同干扰物质后的I-V曲线图（图6）可知，当葡萄糖浓度均为0.5 mM 时，在葡萄糖溶液中分别添加甘露糖、果糖、蔗糖、木糖、半乳糖及多种干扰物质的混合溶液后，各种干扰物质对开启电压的影响均小于1.50%。图7为从图6中13种物质所对应I-V曲线的开启电压。当存在多种干扰物质混合的葡萄糖浓度变化为0.6 mM 时（对应图7中序号坐标分别为8 和13），开启电压变化显着。这一结果表明，基于石墨烯/GaN 肖特基异质结界面在进行Con A修饰后可获得良好的选择性。

图6 在加入不同干扰物质后的I-V图

图7 葡萄糖以及葡萄糖和其他干扰物质的混合溶液的开启电压图

3 结 论

本研究构建了一种基于石墨烯/GaN 肖特基异质结的葡萄糖传感器，该传感器采用电学测量方法，利用所获得的异质结开启电压作为传感特性参数，可实现一定浓度的葡萄糖溶液检测，在传感器结构、实现方式、传感参数方面均具有一定的新颖性。该葡萄糖传感器的灵敏度为189.968 V·M-1，线性范围为1～1 000 μM，最低检测限为0.33 μM，具有良好的储存稳定性和重复性。进一步通过Con A 修饰石墨烯表面，可实现该传感器在复杂环境下的葡萄糖浓度检测。但该传感器尚不能应用于溶液检测，我们将在后续工作中应用表面改性、杂原子掺杂等技术探索石墨烯/GaN 葡萄糖传感器在溶液状态下的测量方法，不断优化传感性能，缩小临床应用差距。