田洪波，卿芙蓉，谢韬，吴素珍，李林福，黄俊云，刘志平，

（1.赣南医学院基础医学院；2.赣南医学院炎症与免疫中心；3.赣南医学院药学院；4.赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）

炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一种慢性、复发性肠道炎症，主要分为克罗恩病（Crohn's Disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）。前者累及消化道任何部位，表现为穿透性肉芽肿性炎症；后者累及直肠近端及结肠黏膜，表现为溃疡性炎症。这两种疾病严重影响患者生活质量［1］。近年来，我国IBD发病率明显上升［2］。因其高发病率及易癌变的特点，对IBD的研究非常必要。但IBD准确的发病机制仍不清楚，目前广泛认为是肠上皮的完整性受损导致肠道免疫系统对肠道菌群发生异常免疫应答，造成过度的免疫应答和炎症［3］。

目前，临床上主要应用一些基础的抗炎药物如氨基水杨酸、糖皮质激素和柳氮磺胺吡啶来治疗IBD［4-6］，但疗效一般，且在皮肤、血液、肾脏、肝脏、胰腺、胃肠道或神经系统方面有不良反应［7-10］。因此，寻找新的不良反应小且疗效高的药物或辅助药物很有必要，这也可以为研究IBD的发病机理提供新的手段。

油茶（Camellia oleifera Abel）为山茶科多年生常绿乔木，属虫媒异花授粉双子叶植物，是世界四大木本油料植物之一［11］。油茶肉质果（Camellia oleifera Abelfleshy fruit）是外担菌（Exobasidium vexans Massee.）侵染油茶幼嫩果而形成的富有营养的中国南方传统野生果［11-13］。但目前人们未对油茶肉质果的使用引起重视。

研究显示，油茶肉质果提取物（Camellia oleifera Abelfleshy fruit extract， CFFE）中的多糖能够诱导糖尿病小鼠肝细胞生产胰岛素，且能使肝脏中转录因子胰十二指肠同源盒基因（Pancreatic duodenal ho⁃meobox-1, PDX-1）的蛋白表达上调［14］。同时油茶肉质果多糖通过降低肌酸、血尿素氮，促炎症细胞因子和纤维化相关蛋白的表达保护链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的肾脏功能［15］。有研究显示，CFFE可能通过清除体内自由基及抗脂质过氧化，减轻对胰岛β细胞的损伤从而降低四氧嘧啶诱导的实验性糖尿病的血糖，降糖效果与消渴丸相当［16-17］。其次，CFFE也能明显抑制小鼠移植性实体瘤生长，抑瘤能力在已知20种抗癌蔬菜中排名第9，抑瘤率为54.19%［18］。通过急性毒性试验、微核实验和精子致畸实验证明，CFFE无毒、无致突变活性，且能显着抑制金黄色葡萄球菌生长［19］，提示CFFE在抗氧化抑菌方面发挥重要作用。结肠炎发病与氧化应激和异常免疫反应密切相关，但油茶肉质果在结肠炎中的作用尚未见报道。我们推测CFFE存在多种抗炎化合物，能够有效调节小鼠结肠炎的发生，在肠道炎症的预防和治疗中起作用。

1 材料和方法

1.1 CFFE提取 油茶肉质果在2016年清明节前后采集于江西省吉安市，并由赣南医学院李加林副教授鉴定。样本处理按照文献［14-15］，将样品清洗、干燥并且切成小块，再用高速粉碎机将其磨成细粉。将研磨后的材料在室温下溶解于蒸馏水，然后在（99±1） ℃下萃取2 h。离心提取物，收集上清液并在70 ℃减压浓缩。用3倍体积的乙醇沉淀该溶液，并通过过滤收集沉淀物，将其重新溶解在蒸馏水中。用Sevage法去除蛋白质后，将提取物溶液用蒸馏水充分透析并冷冻干燥，然后将油茶肉质果的提取物在-20 ℃下保存用于动物实验。

1.2 液相色谱质谱联用技术（LC-MS） 将油茶肉质果的提取物以1.0 mg·mL-1溶解在80%甲醇水溶液中，用于LC-MS分析。液相色谱分离（HPLC）采用Ultimate 3000液相色谱仪（Thermofisher）进行。色谱条件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相A：0.1%甲酸-水，流动相B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；进样量：5 µL；自动进样器温度：10 ℃。梯度洗脱条件：0～60 min，5%～95%流动相B乙腈。质谱条件ESI离子源，正离子检测模式下喷雾电压：3.2 KV，负离子检测模式下喷雾电压：2.8 KV；毛细管温度：320 ℃；保护气体流速：30 L·min-1；辅助气体流速：10 L·min-1；扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围：100～1 500 m/z，阶梯碰撞能量：20、40、60 V。

1.3 动物和实验设计 健康C57BL/6小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，6～7周龄，饲养在赣南医学院实验动物中心。本研究评价了CFFE对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。首先将小鼠随机分为4组。除对照（Control）组外，其余各组均于第21天在饮水中加入3% DSS诱导结肠炎。由于收集的油茶肉质果提取物数量有限，药物组只设了高剂量组和低剂量组。实验小鼠分组：⑴Control组，无处理，正常饲养28天；⑵PBS+DSS组（每日灌胃PBS，连续21天，之后开始在饮水中加入3% DSS）；⑶CFFE-H+DSS组［每日灌胃0.05 mL·（10 g）-1CFFE，连续21天，之后开始饮水中加入3% DSS］；⑷CFFE-L+DSS组［每日灌胃0.025 mL·（10 g）-1CFFE，连续21天，之后开始在饮水中加入3%DSS］。实验过程中记录小鼠体重变化。实验结束后（第28天）处死小鼠，收集结肠样本，测定结肠长度。

1.4 逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR） 使用Trizol（Invitrogen）从结肠组织中提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒（Takara Japan）合成cDNA。再用荧光定量PCR检测β肌动蛋白（Actb）、白细胞介素-6（Il-6）、肿瘤坏死因子-ɑ（Tnf）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和角质细胞趋化因子（KC）的mRNA表达水平。PCR循环包括95 ℃变性5 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算各组mRNA相对表达量。用于PCR分析的引物序列如表1。

表1 小鼠RT-qPCR引物序列表

1.5 ELISA分析 收集结肠样本，按照Mouse IL-6（Interleukin 6）ELISA Kit和Mouse TNF-α（Tumor Necrosis Factor alpha） ELISA Kit（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，武汉）要求处理样本，测定IL-6和TNF-α蛋白表达水平。

1.6 Western-blot分析 结肠组织在含有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的蛋白裂解液中匀浆，12 000 rpm离心30 min收集上清。用BCA法测蛋白上清浓度。20 ng蛋白样品于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，25 V转膜25 min。之后放入5%的脱脂奶粉中37 ℃封闭1 h，加入IκB、p-IκB、p38、p-p38、Erk、p-Erk、Jnk和p-Jnk一抗（1∶1 000，CST，UK）和内参抗体β-actin（1∶8 000，Sigma），4 ℃孵育过夜，漂洗，加二抗室温孵育1 h，滴加ECL发光液（Thermo Fisher，USA）曝光显示条带。

1.7 统计学分析 使用Graphpad Prism 8.0进行数据分析。数据采用平均数±标准差表示。组内比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），Post-hoc测试使用Dunnett's test检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFFE的成分分析 首先，对提取得到的CFFE进行LC-MS分析，然后将得到的数据在mzVault、chemspider及mzCloud数据库中进行比对检索，确定CFFE的主要成分。其中包括已知的多种抗炎化合物，如茶多酚（图1A和1B），山柰酚（图1C和1D）和槲皮素（图1E和1F）等。

图1 LC-MS鉴定CFFE的成分

2.2 CFFE灌胃预防小鼠结肠炎作用 与Control组相比，PBS+DSS组在DSS处理后第5天体重开始出现显着性下降，并在第8天体重下降14.8%，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组体重下降程度明显减轻，而CFFE-L+DSS组体重下降程度差异无统计学意义（图2A）。在结肠长度方面，与Control组相比，PBS+DSS组结肠缩短程度显着下调，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组和CFFE-L+DSS组结肠长度显着性增加（图2B）。通过对结肠外观的观察发现Control组结肠呈正常浅红色，粪便呈颗粒状，PBS+DSS组结肠呈暗红色，肠壁肿胀、出血，粪便稀薄，而与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组和CFFE-L+DSS组的结肠外观有所改善（图2C）。为了观察各组小鼠结肠组织损伤，我们进行了病理分析。结肠组织HE染色结果显示，Control组结肠无炎症细胞浸润，隐窝解构清晰，PBS+DSS组结肠有大量炎症细胞浸润，隐窝结构被破坏，出现小面积溃疡为特征的组织病理学变化，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组结肠炎症细胞浸润程度和隐窝结构破坏程度有所减轻，CFFE-L+DSS组结肠仍有大量炎症细胞浸润，有溃疡为特征的组织病理学变化（图2D）。

图2 CFFE处理对结肠炎小鼠的影响

2.3 CFFE处理对结肠炎小鼠的促炎细胞因子基因表达的影响 与Control组相比，PBS+DSS组结肠Il-6和Tnf基因表达水平显着升高，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组结肠组织Il-6和Tnf基因表达水平降低，CFFE-L+DSS组结肠组织Il-6的基因表达无显着性差异，但Tnf的基因表达水平降低（图3A和3B）。同时，与Control组相比，PBS+DSS组结肠MCP-1的基因表达水平显着升高，而KC的基因表达水平差异无统计学意义，但有增加的趋势，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组和CFFE-L+DSS组的MCP-1和KC表达差异无统计学意义，但CFFE-H+DSS组结肠的MCP-1呈一定的下降趋势（图3C和3D）。此外，与PBS+DSS组相比，CFFE-H+DSS组和CFFE-L+DSS组结肠组织IL-6和TNF-α蛋白分泌水平显着降低（图3E和3F）。

图3 CFFE处理对结肠促炎症细胞因子表达的影响

2.4 CFFE处理对炎症信号通路激活的影响 4组小鼠结肠组织中IκB、磷酸化（p-IκB）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）、磷酸化p38（p-p38）、细胞外信号调节蛋白激酶（Erk）、磷酸化Erk（p-Erk）7蛋白表达水平差异无统计学意义，而PBS+DSS组磷酸化Jnk（p-Jnk）蛋白表达水平同Control组相比明显升高，CFFE-H+DSS组结肠组织p-Jnk蛋白表达水平明显弱于PBS+DSS组，差异有统计学意义（图4）。

图4 CFFE处理可抑制小鼠结肠Jnk的活化

3 讨论

肠道是机体病原微生物聚集的主要部位，异常的免疫反应是IBD反复发作的主要原因。维持肠道稳态至关重要，增强肠道的抗炎能力将有助于IBD易感个体维持和改善肠道健康状态。油茶肉质果是一种可食用的优质水果，且具有抗炎抗氧化作用，但目前关于油茶肉质果对结肠炎的影响尚无实验研究报道。

本研究中，我们探讨CFFE是否能有效预防实验性结肠炎的发展，其中体重减轻和结肠缩短是DSS诱导的结肠炎的主要特征；促炎症细胞因子IL-6是由T细胞和巨噬细胞产生的刺激免疫反应中主要的促炎症细胞因子之一［20］；TNF-α是来源于活化的巨噬细胞的经典细胞因子之一；MCP-1和KC是诱导中性粒细胞和巨噬细胞迁移的趋化因子［21］。我们观察到，高浓度的CFFP能显着改善结肠炎的一些主要特征，包括体重变化、结肠长度、促炎症细胞因子的表达。

MAPK超家族由三条主要信号通路组成：Erk、Jnk和p38［22］。参与调控多种细胞过程，能将胞外刺激信号转导成胞内的转录和翻译后效应，参与调节炎症、疼痛等多种病理生理过程［22-23］。在MAPK通路的级联反应中，根据细胞和刺激不同来激活相应的MAPK激酶及下游分子［24］，其中Erk主要由MKK1激活［24］，P38主要由MKK3/6和MKK4激活［25］，Jnk由MKK4和MKK7激活［26］，使这些蛋白分子在不同疾病中发挥独特作用。有文献报道，Jnk抑制剂阻断Jnk通路后可以缓解DSS诱导的结肠炎模型的肠道炎症［27］。本研究发现CFFP能显着抑制Jnk的活化。提示CFFP可能对结肠炎的发生有一定的抑制作用。

本研究也存在一定的局限性：首先，CFFE是一种复杂的化合物，虽然我们鉴定了CFFP的一些抗炎生物活性成分，但对于其他成分可能的作用还不清楚。第二，由于CFFE来源有限，我们只选择了两种浓度，对最佳的浓度还有待进一步研究。第三，除了对体内研究外，尚未进行体外研究，保护肠道机制还不够深入。

综上所述，我们目前的研究表明，CFFE可能通过抑制Jnk通路激活和炎症因子表达预防结肠炎。