张 婧，童 云，朱艺华，唐晓璐，李延柠
（1. 赣南医学院公共卫生与健康管理学院；2. 赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000）
氯胺酮是非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDAR）的拮抗剂，在临床上作为一种分离性麻醉剂用于手术麻醉。临床所用的氯胺酮是等量对映体右旋氯胺酮和左旋氯胺酮的外消旋混合物。艾司氯胺酮（Esketamine， ESK）作为氯胺酮的右旋单体，与NMDAR 的亲和力比左旋单体高3～4 倍，镇静、镇痛效果更佳。临床上艾司氯胺酮的应用广泛，在抗抑郁方面的作用尤为突出，单次注射不同浓度的艾司氯胺酮后，即可产生不同程度的抗抑郁效果［1］。大量研究已证实，长期反复给予氯胺酮能产生强烈的致欣快作用及神经组织损伤，氯胺酮的不良反应呈剂量相关性，艾司氯胺酮的给药剂量是氯胺酮的一半，因此其产生的不良反应更小。有研究显示，艾司氯胺酮可引起拟精神病和解离不良反应［2］，但对于其他方面的不良反应研究较少，且存在分歧。为探究这一问题，本实验以小鼠为研究对象，采用自发活动实验和新物体识别实验观察艾司氯胺酮对小鼠自发活动和认知功能的影响，并检测小鼠体质量变化。临床上艾司氯胺酮治疗难治性抑郁症最多不超过每周3 次用药，且药物用量主要为10 mg·kg-1和20 mg·kg-1［3］，因此，本实验采用艾司氯胺酮每周注射1次及3次，并使用3种剂量（10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1），观察不同频次和剂量给药对小鼠行为的影响，为进一步研究艾司氯胺酮的用药安全性和预防药物滥用提供参考数据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），8 周龄，体质量18～23 g，在12 h 光照/12 h 黑暗、舒适和安静的环境中饲养，自由获取食物和水。按完全随机设计将80 只小鼠根据给药频次分为每周1 次组和每周3 次组，每组再根据给药浓度分为生理盐水组（Saline组）和艾司氯胺酮实验组（10 mg·kg-1组、20 mg·kg-1组及40 mg·kg-1组），每组10 只小鼠，持续腹腔注射8 周。本研究经赣南医学院动物伦理委员会批准。
1.2 药物和试剂盐酸艾司氯胺酮，购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为210220BL，规格为2 mL∶50 mg。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 自发活动检测通过旷场实验观察小鼠自发活动。旷场装置为一个白底、无顶黑色塑料箱，大小40 cm×40 cm×30 cm。将小鼠从旷场一角置入，自由活动10 min，视频采集系统记录小鼠的运动总距离。每只小鼠测试完后使用70%乙醇擦拭箱底，去除气味痕迹。
1.3.2 新物体识别实验实验分为适应、训练和测试3 个阶段。适应阶段：各组小鼠在场地自由探索10 min，熟悉箱子环境。训练阶段：第2 天在箱子两侧分别放入两个完全相同的圆锥体，两个物体距离最近的角落保持相同的距离，让小鼠在场地自由探索5 min。测试阶段：1 h 后将其中一个圆锥体置换成一个材质相同、大小相等、颜色不同的圆柱体，让小鼠在场地内进行自由探索。视频采集系统记录小鼠分别对新、旧物体的探索时间（物体探索时间定义为小鼠将鼻子指向物体周围3 cm 以内的时间），分析小鼠探索新物体时间占比。
1.3.3 体质量检测未给予药物处理时初次测量体质量；间断性注射艾司氯胺酮期间，每周测量体质量1次。
1.4 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，每周1 次及每周3 次给药组分别采用单因素方差分析，随后采用Newman-Keuls 法进行组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 长期间断注射艾司氯胺酮对小鼠自发活动的影响每周1 次组中，各剂量实验组小鼠与生理盐水组相比，其自发活动的总运动距离均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），其中10 mg·kg-1剂量组的差异最为显着（图1A）。每周3 次组中，各剂量实验组小鼠的总运动距离也均有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图1B）。
2.2 长期间断注射艾司氯胺酮对小鼠认知功能的影响长期间断注射艾司氯胺酮后，各剂量组小鼠在新物体识别实验中的新物体探索时间占比相较于生理盐水组差异均无统计学意义（P＞0.05）（图2）。
2.3 长期间断注射艾司氯胺酮对小鼠体质量的影响长期间断注射艾司氯胺酮后，各剂量组小鼠的体质量相比于生理盐水组无明显变化（图3）。
图3 长期间断注射艾司氯胺酮对小鼠体质量变化的影响
3 讨论
氯胺酮作为一种分离性麻醉剂多用于临床手术麻醉，但由于具有致幻、致欣快等药物滥用潜力，近年来已成为了一种新型毒品席卷全球，其非法制造、贩卖以及非医疗用途在全球范围内不断增加［4-5］。氯胺酮滥用会对机体产生严重不良反应，根据滥用者描述，使用氯胺酮后出现幻觉以及时间和空间扭曲的分离症状，长期使用可出现持续的精神分裂样表现［6］。此外，研究发现，氯胺酮在高剂量或作为滥用药物使用时可以引起短暂、可逆或持久的认知障碍，氯胺酮依赖者存在明显的认知功能损害［7］。氯胺酮和其他NMDAR 拮抗剂，如MK-801 和PCP，在精神分裂症动物模型中可诱发认知障碍，对人也有拟精神病作用［8］。
艾司氯胺酮作为氯胺酮的右旋异构体，对NMDAR具有更强的亲和力，在临床上用于重度抑郁症的治疗。研究报道，艾司氯胺酮治疗抵抗性抑郁症效果明显，且发挥作用时间短［9］。艾司氯胺酮在抗抑郁方面发挥作用的同时也表现出了一些毒副作用。据报道，艾司氯胺酮在抑郁症患者中引起拟精神病和解离作用［10-11］。单次注射艾司氯胺酮即能诱导猴纹状体区多巴胺神经递质的释放，这可能与人的急性拟精神病和解离不良反应相关［12］。使用高剂量（50 和75 mg·kg-1）艾司氯胺酮单次给药后引起大鼠压后皮质中热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP-70）表达［1］，中枢神经系统中的HSP-70 被认为是可逆性神经元损伤的敏感标志物，在细胞修复和保护机制中起重要作用［13-14］，HSP-70 的诱导可能是这些神经元对艾司氯胺酮神经毒性的代偿性反应。在25 μM 的艾司氯胺酮中孵育24 h 后，海马神经元中促凋亡蛋白Bax（BCL2-Associated X protein，Bax）表达增加［15］，提示艾司氯胺酮可能导致细胞凋亡。
在认知功能方面，有临床试验显示，艾司氯胺酮鼻内给药可引起短暂性认知障碍［16］。IDE S 等［17］研究证实，10 mg·kg-1及20 mg·kg-1的艾司氯胺酮腹腔注射会损害小鼠识别记忆能力。重复间歇给予艾司氯胺酮会导致小鼠内侧前额叶和海马中小白蛋白（Parvalbumin， PV）免疫活性丧失，艾司氯胺酮引起的认知障碍可能与此相关［18］。但也有文献表明，艾司氯胺酮不会对抵抗性抑郁症患者产生显着的认知损害［19］。研究者利用改良的Y-迷宫进行实验，结果表明，高剂量的氯胺酮损害小鼠空间记忆，但艾司氯胺酮对认知能力无影响［20］。可见，艾司氯胺酮是否影响认知功能尚存在分歧，不同的研究结果可能与艾司氯胺酮的差异给药方式相关。本实验结果显示，每周1 次或3 次注射艾司氯胺酮未损害小鼠的认知功能，表明长期间断给予艾司氯胺酮在此方面有较高的安全性。
文献报道，艾司氯胺酮可以引起小鼠自发活动增强，单次注射艾司氯胺酮的小鼠总运动距离明显增加［21］，且呈现剂量依赖性，但过度活跃后很快恢复至正常水平［22］。在45 min 的运动能力测试［20］中，单次注射10 mg·kg-1的艾司氯胺酮后5 min 出现运动能力增强、摇头不止等行为反应，提示艾司氯胺酮诱导自发活动增加，但低于该剂量的艾司氯胺酮未引起上述行为变化［23］。本实验结果显示，每周1次长期间断注射艾司氯胺酮显着增加小鼠的自发活动，每周3 次长期间断注射艾司氯胺酮后小鼠的总运动距离也均有小幅增加，但差异无统计学意义，提示每周1 次长期间断注射艾司氯胺酮可以增强小鼠兴奋性。
临床应用中，艾司氯胺酮常用于与镇静麻醉药联合诱导和实施全身麻醉，当仅用艾司氯胺酮麻醉时，部分患者会产生恢复期剂量依赖性反应。有研究者利用条件位置偏好实验（Conditional position preference，CPP）证实，艾司氯胺酮显着增加了CPP评分，且呈剂量依赖性，提示艾司氯胺酮具有一定的成瘾性［22］。本实验未对长期间断艾司氯胺酮给药后的小鼠成瘾行为进行检测，艾司氯胺酮长期使用是否具有成瘾性需要进一步研究。
综上所述，长期间断注射艾司氯胺酮增加小鼠自发活动，程度随给药剂量和频次有所不同，但未呈现剂量相关性；长期间断注射艾司氯胺酮对小鼠的体质量及认知功能无显着变化。艾司氯胺酮长期使用在其他方面是否存在负向作用有待深入研究。
