miR-124-3p 阻断Wnt/-catenin 信号抑制骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

徐红余，姚麒

骨质疏松是以骨骼强度降低、骨折风险增加为特征的一类老年人常见的骨骼疾病。骨质疏松是临床病理性骨折的常见原因，也是影响人类健康的高危因素之一[1]。成骨细胞由骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化而来，在骨形成中具有重要作用[2]。文献报道，miR-124-3p 在老年小鼠骨组织内明显上调[3]。有研究发现在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的分化过程中miR-124 表达的改变可能影响hBMscs的生物学功能[4]。但miR-124-3p对BMSCs的生物学功能尚待深入。本研究主要探讨miR-124-3p 对BMSCs 细胞增殖、成骨分化的影响，并进一步研究其调控Wnt/ -catenin 信号的作用机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 BMSCs（人源）购自上海泽叶生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 TrizolTM、LipofectamineTM2000 试剂（Invitrogen 公司）；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix（TaKaRa 公司）；CCK8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TransWell小室（上海子起生物科技有限公司）；miR-124-3p 模拟物（miR-124-3p mimics）、阴性对照（mimics-NC）（上海吉玛公司）；胎牛血清、DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；Wnt、-catenin 和cyclin D1 单克隆抗体、HRP标记山羊抗兔IgG 二抗（美国Abcam 公司）；引物均由上海生工生物工程公司设计合成（其中miR-124-3p 引物序列：Forward：5’-GGGTATTGAG-GAAGGTGTT-3’；Reverse：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6：Forward：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3’；Reverse：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）。

1.1.3 主要仪器 1658033 小型蛋白垂直电泳转印系统（武汉科昊佳生物科技有限公司），ABI 7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI公司），美国SHELLAB 2406-2 CO2培养箱（美国SHELLAB 公司），CLARIOstar全功能多功能酶标仪（德国BMG LABTECH 公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将BMSCs 培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 BMSCs的成骨分化 骨髓间充质干BMSCs铺板于6 孔细胞培养板生长至细胞密度为1×104个/孔，经含10%胎牛血清、50 mol/L 抗坏血酸、0.1 mol/L 二甲基亚砜（DMSO）和10 mmol/L -甘油磷酸酯的-MEM 诱导BMSCs 细胞向成骨细胞分化7 d。

1.2.3 细胞转染 分别设置miR-124-3p mimics 组与 miR-124-3p NC 组，待BMSCs细胞培养至对数生长期时，使用胰酶消化细胞，洗涤2 遍后应用完全培养基将细胞调至3.0×106个/ml，取200 l细胞液接种至corning6 孔板中培养24h。分别向3 个EP 管中加入5 l LipofectamineTM2000，5 l LipofectamineTM2000+5 l 阴性质粒miR-124-3pNC，5 l LipofectamineTM2000+5 l miR-124-3p mimics，室温静置5 min 后混合，加入不含血清的DMEM培养基调整终体积至2 ml，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养6 h后，更换完全培养基继续培养，完成BMSCs细胞转染，并继续扩大培养以用于后续实验。

1.2.4 细胞内miR-124-3p的表达 细胞转染成功后，采用RT-qPCR 技术检测细胞内miR-124-3p的表达。收集细胞后，PBS 洗涤2 遍，离心取细胞沉淀，按照TrizolTMReagent 说明书提取BMSCs总RNA，依据4×Reverse Transcription Master Mix 试剂盒说明书将组织总RNA逆转录为总cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 试剂盒说明书操作，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR 反应。反应条件：94 ℃2 min，94 ℃20 s，60 ℃30 s，共40 个循环。以U6 为内参，miR-124-3p基因的相对表达量以2－Ct表示。

1.2.5 细胞增殖水平 待转染后的BMSCs细胞生长至对数期时，使用胰酶消化细胞，并洗涤2遍，然后应用完全培养基将细胞调至3.0×103个/ml，每孔（96 孔板）接种100 l细胞液。分别培养24、48 及72h，加入配置好的CCK8试剂（10 l CCK8 试剂＋90 l 完全培养基）孵育2 h，采用酶标仪检测450nm 波长处的吸光值（OD450）。

1.2.6 细胞克隆实验 两组细胞以200个/皿接种于60 mm的细胞培养皿（含10 ml 培养液）中，置37℃、5%CO2的培养箱中孵育，2 周后肉眼可见细胞克隆的形成。小心吸弃培养液，用PBS 洗涤2 次，将两组细胞以4%的多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的结晶紫染色20 min，用清水清洗染液并风干，于荧光显微镜下随机选取5 个视野统计形成的细胞克隆数（＞50 个克隆数为有效克隆）。

1.2.7 成骨分化相关因子测定 消化BMSCs 细胞后采用RT-qPCR 技术检测细胞内miR-124-3p的表达。收集细胞后，PBS 洗涤2 遍，离心取细胞沉淀，按照“1.2.4”项下RT-qPCR 方法测定碱性磷酸酶（ALP）、Runt 相关转录因2（RUNX2）、骨钙素（OCN）成骨分化相关因子基因表达水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，miR-124-3p 基因的相对表达量以2－Ct表示。各引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

1.2.8 miR-124-3p 对BMSCs 细胞Wnt/-catenin 信号的调控作用 按照1∶10的比例加入放射免疫沉淀（RIPA）裂解液，按二辛喹酸（BCA）蛋白定量试剂盒说明书方法测定所提取的各组细胞的总蛋白含量，以确保每组样本之间的上样量相同。裂解、提取各组蛋白后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离，转至硝酸纤维素（PVDF）膜，将转好的PVDF 膜于5% 脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h，Tris-HCl 缓冲盐+Tween（TBST）洗涤液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育过夜。再漂洗3～4 次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗体，室温孵育2 h，漂洗3～4 次。化学发光检测底物电化学发光（ECL）工作液显色，采用Image J 图像分析系统对蛋白显影图进行灰度分析，以GAPDH 为内参，分析并比较两组Wingless/Integrated（Wnt）、-连环蛋白（-catenin）和细胞周期素D1（cyclin D1）蛋白相对表达水平。

1.3 统计方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，应用LSD-检验。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后BMSCs细胞miR-124-3p的表达及其对细胞增殖的影响 BMSCs细胞转染miR-124-3p 后，miR-124-3p 相对表达高于miR-124-3pNC 组（=9.512＜0.05）。miR-124-3pmimics 组转染48h和72 h的OD450 值均低于miR-124-3p NC组（=14.781，17.247，均＜0.05），见图1。

图1 miR-124-3p 对BMSCs 细胞增殖的影响

2.2 miR-124-3p 对BMSCs细胞克隆的影响 miR-124-3p mimics 组细胞克隆形成数为61.8±5.3，低于miR-124-3p NC组的142.7±18.2，差异有统计学意义（=19.743＜0.05）。见图2。

图2 miR-124-3p 对BMSCs 细胞克隆的影响

2.3 miR-124-3p 对BMSCs细胞成骨分化相关因子表达的影响 miR-124-3p mimics 组ALP、RUNX2 和OCN 水平均低 于 miR-124-3p NC 组（=9.641、17.264、14.361，均＜0.01）。见表2。

表2 转染后两组成骨分化相关因子水平比较

2.4 miR-124-3p 对BMSCs 细胞Wnt/-catenin 信号的影响 miR-124-3p mimics 组Wnt/ -catenin 信号中关键靶点Wnt、-catenin 和cyclin D1 蛋白相对表达均低于miR-124-3p NC 组（=9.517、18.204、7.353，均＜0.01）。见图3。

图3 miR-124-3p 对BMSCs 细胞Wnt/ -catenin 信号的影响

3 讨论

骨质疏松的发病率在超50 岁人群中逐渐升高，且女性发病率高于男性，发病后严重影响生活质量[5-6]，故寻找新的药物靶点已成为近年的研究热点。miRNA 可通过调控BMSCs 细胞增殖、凋亡和成骨分化，在成骨过程中扮演重要角色，影响骨代谢，可作为其生物学特性、病因学的分子标志物[7-8]。

miR-124-3p在老年小鼠中表达上调，具有对hBMSCs向成骨细胞分化的负性调控作用[3]。但国内关于miR-124-3p 与成骨分化的发生发展及相关机制的研究较少。本研究显示miR-124-3p mimics组miR-124-3p 高表达；转染48 h 后，miR-124-3p mimics 组细胞增殖低于miR-124-3p NC组，细胞克隆形成数低于miR-124-3p NC 组。这提示miR-124-3p可抑制BMSCs 细胞增殖。研究指出，成骨细胞的分化过程同时受到一系列蛋白调节，如ALP、RUNX2、OCN[8-9]。与健康人相比，骨质疏松患者的ALP、RUNX2和OCN 等成骨相关因子通常较低。此外，RUNX2 在调节成骨细胞和软骨细胞分化中起关键作用[10]。故ALP、RUNX2 和OCN 可作为骨质疏松或成骨分化的生物标志物。本研究显示，miR-124-3pmimics 组ALP、RUNX2和OCN水平低于miR-124-3p NC 组，可见miR-124-3p 可抑制BMSCs的成骨分化，从而影响骨代谢过程。

目前，Wnt/ -catenin 是常见信号转导通路，参与控制多种生物现象。成骨细胞分化已被证实受Wnt/ -catenin 途径的调节。先前研究已经证明Wnt/ -catenin途径在骨质疏松的发病和进展中具有关键作用，也被认为是治疗骨质疏松的靶点[11]。而探讨成骨细胞分化过程中Wnt/ -catenin 经典信号与相关调节蛋白的相互关系较少[12]。本研究显示miR-124-3p mimics 组Wnt/ -catenin 信号中关键靶点Wnt、-catenin 和cyclin D1 蛋白相对表达均低于miR-124-3p NC组。这提示miR-124-3p 可抑制Wnt/ -catenin信号，从而阻止BMSCs向成骨分化。

综上所述，miR-124-3p 可阻碍BMSCs增殖，逆转成骨分化，可能与抑制Wnt/ -catenin 信号有关。为进一步研究miR-124-3p调控骨代谢的作用奠定基础，并为骨质疏松的基因靶点治疗提供参考。