人脐血间充质干细胞治疗终末期肝病的进展

姚 勇综述，曾维政，戴立里△审校

（1.重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010；2.成都军区总医院消化内科，成都 610083）

目前我国的乙型肝炎病毒携带者超过l亿，是终末期肝病患者的主要来源人群。终末期肝病患者常发生胃底－食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病等严重并发症，每年死亡人数超过30万，是严重影响健康的社会问题。同种异体肝移植被认为是治疗终末期肝病的最佳手段，临床肝移植术已经成为一种公认的治疗终末期肝病的常规手术，由于受到供体的限制、手术本身潜在风险以及移植后发生移植物抗宿主病，治疗费用昂贵，其临床应用受到很大限制，因此迫切需要一种替代疗法或过渡疗法。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有独特的免疫调节作用、能自我更新、跨胚层多向分化的特点，近年来MSCs原位肝移植治疗终末期肝病已成为国内外的研究热点，移植手术风险较小、费用较低。但多数研究均以骨髓及脂肪，尤其骨髓来源的MSCs原位肝移植多见［1］，而脐血间充质干细胞（umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs）原位肝移植的研究较少，现将UCB-MSCs向肝细胞诱导分化及治疗终末期肝病的相关研究及进展综述如下。

1 UCB-MSCs概述

MSCs来源于发育早期的中胚层和外胚层，是干细胞家族的重要成员，可来自骨髓、脐带血、脂肪组织以及胎儿肝脏、肺脏、血、骨髓等。UCB-MSCs具有和骨髓来源的 MSCs相似的形态、表型特征和多向分化潜能［2］，可合成多种生长因子和细胞因子，对肝脏内局部微环境产生营养性旁分泌作用［3］。UCB-MSCs在体内或体外，可分化为肝、骨、脂肪、肌肉、肌腱、韧带、心肌、神经等多种组织细胞，并且经过连续传代培养和冷冻保存后仍然具有多向分化的潜能，可作为理想的种子细胞用于病变或衰老引起的组织器官损伤的修复［4］。任红英等［5］研究证实UCB-MSCs在体外能分化为有功能的肝样细胞，能以时间依赖方式产生清蛋白和分泌尿素，能够抑制淋巴细胞增殖，具有低免疫原性的特征。

2 UCB-MSCs的采集、分离与培养

通常选择健康足月顺产或剖宫产的新生儿的脐血采集UCB-MSCs，脐血采集后需在6h内进行处理，切除双侧带夹痕及瘀血的部分，可选择植块法、胶原酶消化法或胶原酶联合胰酶消化法等获取细胞，窦慧慧等［6］认为足月分娩、新鲜脐带、采用组织块平铺法和MesencultTM培养基，对UCB-MSCs的采集、分离、培养成功率较高。UCB-MSCs的分离方法现在仍缺乏统一的方案，获得较多数量且活性高的干细胞仍困难重重。目前采用的分离方法为：（1）密度梯度离心及贴壁细胞分离法［7］：根据细胞的密度差异从脐血中离心分离出单个核细胞后，利用UCB-MSCs具有贴壁生长的特性，用贴壁法将其分离。（2）免疫磁珠分离法：运用表面带有特异抗体标记的免疫磁珠与干细胞相结合，通过永久磁铁的磁性吸附出细胞。（3）流式细胞仪分离法［8］：流式细胞仪根据细胞表面的不同标记及大小的差异进行分离；（4）单细胞克隆法［9］。运用较多、较成熟的还是密度梯度离心、贴壁细胞分离法，该法虽然分离所得细胞纯度不高，但简单易行，成本较低，能较好地保持干细胞的活性。

3 UCB-MSCs的表面标记

UCB-MSCs是混合的细胞群体，既有间质细胞，又有上皮细胞和内皮细胞的特征，而无真正意义上的特异性标志。流式细胞学检测发现，UCB-MSCs与骨髓间充质干细胞相似，不表达造血细胞标记CD45、CD34等，不表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子及人白细胞抗原识别有关的共刺激分子，也不表达内皮细胞标记（如vWF、KDR和CD31），但整合素和黏附分子CD95、CD90、CD105、CD44、CD73等的表达率可达 95% 以上［10］。研究认为其表面的标记基本可分为3类：（1）黏附分子：CD13、CD54、CD44、CD51等；（1）整合素家族：CD49b（＿2-integrin）、CD29（＿1-integrin）、CD49d（＿4-integrin）、CD51（＿vintegrin）；（3）其他：ASMA、CD90（Thy1）和 SH2（CD105）、HLA-ABG和 SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等［7，11］。

4 UCB-MSCs向肝细胞的诱导分化

4.1 体外诱导分化为肝细胞的方法

UCB-MSCs具有多向分化的潜能，诱导UCB-MSCs向肝细胞分化的主要方法包括细胞因子诱导和理化损伤诱导。

4.1.1 细胞因子诱导 研究者运用较多的可诱导 UCBMSCs向肝细胞转化的细胞因子主要包括促肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、致瘤因子 M（oncostatin M，OSM）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等。由于UCB-MSCs比成体MSCs更加幼稚、原始，利用UCMSCs启动肝细胞的发生信号及传导系统，所需诱导因子的剂量和浓度都较骨髓等来源的MSCs高，方法大致分为以下几种：（1）唐晓鹏等［12］利用 HGF诱导 UC-MSCs分化，成功地诱导了肝细胞的产生；（2）何念海等［13］将 UC-MSCs培养于1%基质胶包被并加有FGF-4的肝细胞生长培养基，不仅表达肝细胞标志，更具有与肝细胞合成代谢活性相一致的功能特征；（3）Chivu等［14］和 Yoon等［15］以 OSM 作 为诱导剂成 功 诱导UCB-MSCs转化 为肝 细 胞；（4）熊 中 华 等［16］联 合 HGF 和FGF4成功诱导 UC-MSCs定向分化为类肝细胞；（5）联合HGF、FGF及OSM为诱导剂，高蕾等［17］采用阶段诱导法，诱导UCB-MSCs向肝细胞转化，结果在4周内观察到了所诱导细胞形态的改变，运用RT-PCR检测到在形态发生改变的细胞内存在甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）mRNA的表达。

4.1.2 理化损伤诱导 过去有研究证实，MSCs在受到理化损伤后可向肝细胞分化，如骨髓MSCs经47℃热休克损伤30 min，再与肝细胞共培养，利于其向肝细胞的分化。Wang等［18］的研究发现用物理刺激因素（体外冲击波）可以刺激UCBMSCs的分化、扩增。

4.2 体内诱导分化为肝细胞 Tsai等［19］将经荧光原位杂交和免疫组化标志的UCB-MSCs通过肝门静脉注射给模型大鼠体内（四氯化碳腹腔内注射制造的肝坏死模型），移植8周后从大鼠肝组织内检出了原位杂交和免疫组化阳性标志的人清蛋白mRNA。张丽欣等［20］用UCB-MSCs移植给失代偿期肝硬化患者，移植后患者的转氨酶、清蛋白等指标明显好转，原因可能与UCB-MSCs在慢性肝损伤时在体内分化为成熟的肝细胞有关。目前，UCB-MSCs在人体内的相关诱导分化研究较少，还待进一步动物实验和临床研究来证实。

4.3 分化为肝细胞的可能机制 多数学者认为UCB-MSCs分化为肝细胞的可能机制包括横向分化和细胞融合两种机制。横向分化是指特定的细胞外信号激活启动干细胞分化程序，通过基因重组，使某种已分化的细胞（在未发生细胞分裂的情况下）直接转变成另一种分化的细胞过程。而细胞融合是指在HGF及FGF等内源性细胞因子刺激诱导下，细胞之间发生细胞质的混合及核基因的重组从而实现干细胞的分化。UCBMSCs的分化机制可能与选择的肝损伤的不同模型、实验方法、移植细胞的类型以及分析技术的方法有关。研究者在多数诱导分化实验中未发现细胞融合现象，故多倾向于细胞横向分化的机制可能性更大［21－22］。

5 UCB-MSCs原位肝移植治疗终末期肝病

急、慢性肝损伤均有利于骨髓源性及脐血源性干细胞的形成和定植，其中慢性肝损伤对其更有利，提示肝纤维化或肝硬化可能更适于采取UCB-MSCs移植方法治疗［23］。UCB-MSCs抗纤维化的可能机制：（1）UCB-MSCs通过直接抑制肝星状细胞的激活或诱导肝星状细胞的凋亡，分泌多种细胞生长因子、抗纤维化物质如HGF、G-CSF等，减少细胞外基质的积聚。（2）UCB-MSCs通过分化为有功能性的肝样细胞，促进宿主体内内源性肝细胞的增殖。国内外学者［20，24］通过门静脉或外周静脉、肝动脉途径对终末期肝病患者进行UCB-MSCs原位肝移植治疗，术后患者肝功明显好转，无不良反应。

5.1 UCB-MSCs体内示踪 师玲玲等［25］将绿色荧光蛋白标记的UCB-MSCs经肝脏局部注射移植于肝坏死的大鼠模型，取大鼠肝组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察标记的UCBMSCs迁徙途径，移植治疗48h移植细胞定居于汇管区，48h后荧光信号向坏死病灶区域迁徙，1周后一定数量的移植细胞在坏死区域弥散定居，免疫组化显示鼠肝组织中有人类肝细胞特异性AFP、清蛋白（albumin，ALB）、Hep parⅠ标记蛋白表达。朱金海和陈燕凌［26］用二脒基苯基吲哚荧光标记UCBMSCs，由门静脉注入大鼠肝移植受体，取肝组织冰冻切片，用荧光显微镜观察UCB-MSCs定位于移植肝内。宗兆文等［27］构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体，能有效地对大鼠体内的干细胞分布进行示踪和定量分析。Theise等［28］将携带Y染色体的干细胞移植到雌性动物肝内，通过Y染色体成功示踪。上述方法需要取得宿主的肝脏组织进行病理学检查，这就对研究移植后的细胞在宿主体内的动态变化带来了较大的困难。

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）是目前在活体状态下观察干细胞体内示踪的最常用的成像方法，居胜红等［29］采用超顺磁性氧化铁标记UCB-MSCs，通过 MRI能较满意地对标记后的UCB-MSCs在体内的迁移、肝内的定居及存活进行示踪，可以较长时间（至少在移植后18周内）进行连续的动态观察。

5.2 UCB-MSCs的移植途径 目前UCB-MSCs移植的途径分为以下两类：（1）经腹腔内注射或经外周静脉内输注，该方式简单、方便易行，但是移植的细胞不易进入肝脏定植，影响治疗效果；（2）经肝动脉或门静脉、脾脏介入途径，方式虽然有一定的创伤性，但移植的干细胞易于进入肝脏定植。张强等［30］研究表明经肝动脉途径既可以进行干细胞原位肝移植，同时在造影检查时还发现了CT等检查不能发现的多例AFP阴性的小肝癌。

5.3 影响 UCB-MSCs移植疗效的因素 （1）UCB-MSCs的分离、诱导及体外培养条件。随着体外培养时间的延长、传代次数的增加，UCB-MSCs对趋化因子受体CXCR4表达量下降，从而减少基质细胞衍生因子-1介导的干细胞的迁移数量［31－32］。（2）移植的干细胞数量（临床有效的移植要求干细胞的数量最好达到109以上）。（3）移植途径直接影响干细胞在肝内的定植、增殖、分化。（4）干细胞移植的时机。（5）引起肝硬化的不同病因、患者的性别、体质量、年龄。（6）体内细胞因子水平。HGF、IL-3、IL-6、SCF等促进 UCB-MSCs细胞内外的CXCR4表达，增加UCB-MSCs的迁移能力；金属蛋白酶－3组织抑制剂抑制 UCB-MSCs的迁移［33］。（7）受体营养状态。受体血浆清蛋白浓度影响UCB-MSCs的迁移，调节血液中清蛋白的浓度，促进干细胞从高浓度部位向低浓度部位迁移［34］。（8）干细胞移植的次数。（9）其他：患者是否存在严重并发症，如消化道出血、自发性腹膜炎等。

6 存在的问题

理论上讲相对完善的干细胞移植应该具有以下特点：干细胞的来源和获取不受伦理、道德、法律的束缚；分离纯化方法简单、重复性好、效率高；具有能方便识别的特异性细胞表面标记；能被有效冻存且复苏后细胞的活性受影响小；在体外实验中可实现细胞间功能的融合，但不会发生细胞间基因的平行转移或结构的融合；可以被克隆分化，具有能分化为肝细胞或胆管细胞的生物学特性；在人体内能实现有效的扩增；在肝损伤的实验模型中表现出临床疗效并且没有潜在恶变的倾向［35］。目前UCB-MSCs治疗终末期肝病的研究，尚未能完全具备以上条件。

UCB-MSCs自身即可表达少量的AFP及清蛋白mRNA。单纯依靠检测AFP及清蛋白mRNA等来判断所诱导细胞系肝细胞可能出现假阳性［36］，仅仅依靠原有方法判断所研究细胞是否系肝细胞凸显出了不足之处。

大部分关于UCB-MSCs对终末期肝病的治疗研究尚停留在体外实验阶段，仅有极少数在人体内治疗的研究报道［37］。国内外学术界对UCB-MSCs在肝病治疗中的作用仍存在较大的争议。

7 UCB-MSCs在终末期肝病治疗中的展望

虽然UCB-MSCs在肝病研究及治疗领域中尚存在较多需要解决的问题，但与其他干细胞相比，具有以下优点：（1）取材方便，易于收集，冷冻保存，不受伦理、道德和法律等方面的限制；（2）人脐带MSCs含量丰富并且较为原始，分化能力更强；（3）UCB-MSCs不表达或低表达免疫排斥相关的标记，不需经过严格配对使用，适宜于不同个体之间的移植，移植无免疫排斥反应或反应较弱，是细胞治疗的理想靶细胞。随着UCBMSCs的提取、分离培养、诱导分化方法的成熟，以及干细胞活体内示踪研究进展，UCB-MSCs在终末期肝病的细胞移植中仍有着良好的应用前景。

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