危志强,秦晓华,徐承云,邹宏昌,徐高四,占锦峰,涂卫平
(南昌大学第二附属医院肾内科 330006)
螺内酯对清蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响*
危志强,秦晓华,徐承云,邹宏昌,徐高四,占锦峰,涂卫平△
(南昌大学第二附属医院肾内科 330006)
目的探讨螺内酯对人清蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生转分化的影响,以及该过程是否通过转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads信号通路发挥作用｡方法 体外培养HK-2细胞,将其随机分为7组:A组(未加刺激物)､B组(加入10-7mol/L螺内酯)､C组(加入5mg/mL清蛋白)､D组(加入5mg/mL清蛋白及10-8mol/L螺内酯)､E组(加入5mg/mL清蛋白及10-7mol/L螺内酯)､F组(加入5mg/mL清蛋白及10-6mol/L螺内酯)､G组(先加10μmol/L TGF-β1拮抗剂,30min后加入5mg/mL清蛋白)｡采用RT-PCR检测TGF-β1和整合素连接激酶(ILK)的mRNA表达;细胞免疫荧光检测上皮钙黏素(E-cadherin)､α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;ELISA 法检测纤维连接蛋白(FN)的蛋白水平｡结果C组ILK mRNA,α-SMA､FN蛋白较其他各组表达明显增高(P0.05),E-cadherin蛋白表达明显下降(P0.05),而TGF-β1mRNA表达高于除 G组以外其余各组(P0.05)｡与 G组相比,C组 TGF-β1mRNA表达差异无统计学意义(P0.05),而ILK mRNA,α-SMA､FN蛋白表达明显下降(P0.05),E-cadherin表达明显升高(P0.05)｡D､E､F组TGF-β1､ILKmRNA､α-SMA,FN蛋白表达逐渐下降,组间两两比较差异有统计学意义(P0.05);E-cadherin的表达逐渐增高(P0.05)｡结论一定浓度的清蛋白可以诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化;螺内酯可抑制人清蛋白诱导HK-2细胞转分化作用,且呈剂量依赖性;TGF-β1/Smads信号通路可能是此过程中的重要通路｡
螺内酯;肾小管;上皮细胞;细胞分化;转化生长因子β
肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)进展为终末期肾衰竭的共同病理途经｡肾小管上皮细胞(HK-2)转分化可介导细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过量沉积,被视为RIF发生､发展的重要机制｡研究表明,蛋白尿是导致RIF的独立危险因素｡大量清蛋白在体外可诱导HK-2发生转分化[1]｡近年来一些研究已证实螺内酯具有抑制肌成纤维细胞转分化､减少蛋白尿､抑制ECM堆积等作用｡有实验表明螺内酯可抑制高糖诱导的HK-2细胞发生转分化[2],但对清蛋白诱导的HK-2发生转分化是否有影响,目前尚无报道｡本实验通过使用人清蛋白刺激导肾小管上皮细胞,并使用不同浓度螺内酯进行干预,检测转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)､整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)mRNA,上皮钙黏素(E-cadherin)､α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)､纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白水平等表达情况,以探讨螺内酯对清蛋白诱导的HK-2细胞发生转分化的影响及其可能的作用机制｡
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 HK-2细胞由中山大学第一附属医院余学清教授惠赠;胎牛血清(FBS)､TRJzol DMEM/F12培养基为美国Gibco公司产品;人纯化清蛋白为北京Solarbio公司产品;螺内酯为美国Sigma产品;单克隆小鼠抗人TGF-β1中和抗体为R&D公司产品;ELISA试剂盒为上海森雄公司产品;兔抗人E-cadherin抗体､兔抗人α-SMA蛋白抗体､FIFC标记羊抗兔二抗为上海博奥森公司产品;RevertAidTM逆转录试剂盒为美国Invitrogen Life Technologies公司产品;5%二氧化碳培养箱为Thermo Forma公司产品;倒置显微镜为日本Nikon公司产品;PCR扩增仪为美国BIOCAD公司产品;核酸､微量蛋白测定仪､凝胶成像和化学发光图像分析系统为美国BIOCAD公司产品｡
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与分组 HK-2细胞培养于规格为25cm2的培养瓶,以10%胎牛血清､含2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12(1∶1)培养基进行培养,培养条件为37℃､5%CO2｡倒置显微镜下观察细胞长至融合度为70%～80%时,用无血清的DMEM/F12培养基同步24h后,随机分为7组,即A组未加刺激物,B组加入10-7mol/L螺内酯,C组加入5mg/mL清蛋白,D组加入5mg/mL清蛋白及10-8mol/L螺内酯,E组加入5mg/mL清蛋白及10-7mol/L螺内酯,F组加入5mg/mL清蛋白及10-6mol/L螺内酯,G组先加10μmol/L TGF-β1拮抗剂,30min后加入5mg/mL清蛋白｡实验重复3次｡
1.2.2 RT-PCR检测 TGF-β1和ILK 的 mRNA 表达 分别收集各组细胞,提取总RNA,均按TRIzol说明书进行｡提取物用微量蛋白/核酸测定仪测定RNA纯度和浓度｡取总RNA 5μL作逆转录操作,按RT-PCR试剂盒说明书进行操作,总反应体积为25μL｡聚合酶链反应引物序列如下,GAPDH:正义链5′-AGT CCA CTG GCG TCT TCA C-3′,反义链5′-GCT TGA CAA AGT GGT CGT TGA-3′;TGF-β1:正义链5′-ACC GCA ACA ACG CAA TCT ATG-3′,反义链5′-ATT CCG TCT CCT TGG TTC AGC-3′;ILK:正义链5′-GCA CTC AAT AGC CGT AGT G-3′,反义链5′-CCT ACT TGT CCT CAT CTT C-3′｡反应条件为:预变性95℃4min,扩增94℃30s,退火30s,72℃1min｡退火温度及循环数分别为ILK 55℃,35个循环;TGF-β154℃,35个循环,最后一个循环后72℃延伸5min｡取各检测物PCR产物8μL,1.2%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统成像,用图像分析处理系统进行灰度扫描分析DNA条带含量,以所得积分吸光度与内参照GAPDH积分吸光度的比值作为半定量值进行分析｡
1.2.3 免疫荧光检测E-cadherin､α-SMA蛋白的表达 HK-2细胞接种于6孔板备置细胞玻片,各组培养24h后,4%多聚甲醛室温固定20min｡参照试剂盒说明书,滴加E-cadherin单抗､α-SMA蛋白单抗(1∶100)4℃过夜,滴加FITC标记二抗孵育40min,中性树胶封片｡在荧光显微镜下观察,随机取3个视野观察,采用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析E-cadherin､α-SMA积分光密度(IOD)值｡
1.2.4 ELISA检测FN蛋白的水平 根据试剂盒说明书对标准品和细胞培养上清液进行检测｡在酶标仪450nm处,以空白对照孔调零,测取吸光度A值,以A450值对FN标准品(ng/mL)在Excel上作标准曲线,根据表本的A值求出FN含量(ng/mL)｡
1.3 统计学处理 用SPSS17.0统计分析软件进行处理,计量资料数据以±s表示,组间采用单因素方差分析,两两比较采用最小显着差LSD-t检验法,以P0.05为差异有统计学意义｡
2 结 果
2.1 细胞TGF-β1和ILK的 mRNA表达结果 A､B组 HK-2细胞TGF-β1和ILK的 mRNA均有微量表达;C组 TGF-β1 mRNA表达水平高于除G组以外其余各组(P0.05),ILK mRNA表达水平较其他各组均明显增高(P0.05);D､E､F组HK-2细胞TGF-β1和ILK的mRNA表达逐渐下降,两组间比较差异统计学意义(P0.05);与C组比较,G组 HK-2细胞TGF-β1mRNA 表达差异无统计学意义(P0.05),而ILK mRNA表达明显下降(P0.05)｡见图1和表1｡
图1 各组HK-2细胞TGF-β1和ILK的mRNA的表达
表1 各组细胞TGF-β1和ILK的mRNA的相对表达量(±s)
表1 各组细胞TGF-β1和ILK的mRNA的相对表达量(±s)
组别 TGF-β1ILK A组0.391±0.015 0.387±0.023 B组 0.385±0.018 0.380±0.030 C组 0.921±0.044 0.662±0.027 D组 0.771±0.017 0.588±0.024 E组 0.590±0.020 0.473±0.017 F组 0.414±0.034 0.407±0.013 G组0.911±0.037 0.384±0.016
2.2 细胞免疫荧光检测细胞 E-cadherin､α-SMA蛋白的表达
各组 HK-2细胞E-cadherin和α-SMA蛋白均有微量表达;C组HK-2细胞α-SMA蛋白表达较其他各组明显增高(P0.05),而E-cadherin表达则明显下降(P0.05);D､E､F组HK-2细胞α-SMA蛋白的表达逐渐下降,E-cadherin蛋白的表达逐渐增高,且组间两两比较差异有统计学意义(P0.05);与C组比较,G组 HK-2细胞 E-cadherin表达明显升高(P0.05),而α-SMA蛋白表达下降(P0.05)｡见表2｡
表2 各组细胞E-cadherin､α-SMA蛋白的表达(±s)
表2 各组细胞E-cadherin､α-SMA蛋白的表达(±s)
组别 α-SMA E-cadherin A组0.371±0.012 1.076±0.055 B组 0.366±0.015 1.069±0.036 C组 0.943±0.050 0.549±0.008 D组 0.796±0.015 0.631±0.023 E组 0.613±0.019 0.722±0.006 F组 0.422±0.025 0.965±0.039 G组0.709±0.033 0.896±0.017
2.3 ELISA法检测上清液FN蛋白的水平 C组细胞上清液中FN蛋白的水平显着高于其他各组(P0.05);D､E､F组上清液中FN蛋白的水平逐渐降低,组间两两比较,差异有统计学意义(P0.05);与C组比较,G组上清液中FN蛋白的水平明显降低(P0.05)｡见表3｡
表3 各组细胞上清液中FN蛋白的水平(±s,pg/mL)
表3 各组细胞上清液中FN蛋白的水平(±s,pg/mL)
组别FN A组194.04±50.62 B组 205.89±53.77 C组 849.57±124.3 D组 671.81±100.57 E组 550.79±72.03 F组 375.63±84.29 G组583.32±107.45
3 讨 论
肾小管上皮细胞转分化发展为RIF,主要经历了4个关键的阶段:(1)上皮细胞间黏附因子(如 E-cadherin)的丢失;(2)间质细胞标记物α-SMA及中间丝波形蛋白表达的增加;(3)细胞骨架重塑及表型的转变致肾小管基底膜的破坏;(4)细胞迁移侵袭能力增强致间质纤维化的发展[3]｡大量研究表明,TGF-β1是诱导肾小管上皮细胞EMT的主要介质,在介导EMT中发挥着至关重要的作用[4],且此作用依赖Smads信号通路[5]｡ILK是一种位于细胞内主要调节细胞黏附､细胞形态以及细胞外基质沉积的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,很多临床表现为蛋白尿的肾脏病模型的研究发现ILK是蛋白尿发生的关键性介 质 之 一[6-7]｡TGF-β1可 促 进ILK 表 达[8]｡研究表 明,ILK作为TGF-β1/Smads信号通路的下游因子参与了EMT的4个关键步骤[9]｡E-cadherin是肾小管上皮细胞转分化过程中的重要的标记蛋白之一[10],其表达的下调被视为是肾小管上皮细胞发生EMT的第一步,是肾间质纤维化的始动环节[11-12]｡实 验 表 明,ILK 表 达 的 增 加 使 E-cadherin表 达 下 调,并上调α-SMA及FN的表达[13]｡
本研究观察提示清蛋白诱导组的TGF-β1､ILK mRNA,α-SMA､FN蛋白的表达较其他组均明显上调,而E-cadherin表达较其他组明显下调｡说明大量清蛋白在体外诱导HK-2细胞发生EMT｡此结果与文献报道[1]有相似｡另外,在螺内酯干预组中,随着螺内酯浓度的加大,TGF-β1､ILK mRNA､α-SMA蛋白､FN蛋白的表达均有所下调,E-cadherin表达上调｡螺内酯可一定程度的抑制清蛋白诱导的 HK-2细胞发生EMT,而且呈一定的剂量依赖性｡与此同时实验发现,TGF-β拮抗剂组较清蛋白诱导组的ILK mRNA表达明显下调,而E-cadherin､α-SMA蛋白､FN蛋白的有所下调,TGF-β1表达无明显差异｡此结果与Bianchi S等研究报道相似[14]｡作者认为此过程可能有TGF-β1/Smads信号通路参与,并可能为主要通路｡
螺内酯是醛固酮非选择性拮抗剂,与其在细胞质膜的盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)的水平上发生直接的拮抗作用,具有利尿､降低血压等作用｡在临床研究中发现,给予CKD患者服用8周螺内酯后,可以显着降低其蛋白尿的水平[14];部分研究证实小剂量螺内酯联合ACEI尚可以有效减少CKD的尿蛋白排泄[15]｡动物实验表明,醛固酮选择性拮抗剂也能显着降低糖尿病大鼠肾脏组织MR mRNA的表达,从而减少蛋白尿[16];Taira等[17]报告螺内酯在单肾切除的糖尿病大鼠中,可降低肾组织TGF-β1,减缓小管间质纤维化｡笔者认为本实验从细胞分子水平上,进一步阐述了螺内酯对清蛋白导致肾脏损害的保护作用｡但其具体作用机制有待进一步研究｡
综上所述,清蛋白可上调 TGF-β1､ILK mRNA和α-SMA､FN蛋白,而下调E-cadherin蛋白表达,螺内酯则反之,提示一定浓度的人清蛋白可以诱导体外培养的 HK-2细胞发生EMT,螺内酯可一定程度的抑制此过程｡另外本实验提示;螺内酯抑制清蛋白诱导的HK-2发生EMT呈一定的剂量依赖性,而且与TGF-β1/Smads信号通路有关｡但其具体的作用机制仍不明确｡本实验提示螺内酯对肾脏疾病具有保护效应,为寻找缓解肾脏疾病进展的新策略有一定意义｡
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Effects of spironolactone on albumin induced transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells*
ObjectiveTo discuss the effects of spironolactone(SPI)on albumin(Alb)induced transdifferentiation of human kidney proximal renal tubular epithelial cells(HK-2cells),and whether the process through TGF-β1/Smads signaling pathways.MethodsIn vitro HK-2cells were randomly divided into the following seven groups:group A (without stimulus),group B (10-7mol/L SPI),group C(5mg/mL Alb),group D (5mg/mL Alb+ 10-8mol/L SPI),group E (5mg/mL Alb+ 10-7mol/L SPI),group F(5mg/mL Alb+10-6mol/L SPI),group G (10μmol/L TGF-β1antagonist)30min later adding 5mg/mL Alb).Using RT-PCR to detect TGF-β1and ILK mRNA expressions;Immunofluorescence detection in E-cadherin andα-SMA proteins expression;ELISA assay for detection of FN protein levels.ResultsIn group C,compared with other groups,ILK mRNA andα-SMA,FN proteins expression were higher than other groups(P0.05),but E-cadherin protein express declined obviously(P0.05),at the same time,TGF-β1mRNA expression was higher than other groups except group G(P0.05).Compared with the group G,TGF-β1mRNA expression of group C was no obviously difference(P0.05),but ILK mRNA andα-SMA,E-cadherin,FN proteins expression were distinctly decreased(P0.05).In group D,E,F,TGF-β1,ILK mRNA andα-SMA,FN proteins expressions had descended gradually(P0.05).Compared with any two of them,these expressions had obviously decreased(P0.05).On the contrary,E-cadherin expression was in the opposite direction(P0.05).ConclusionA certain concentration of albumin can be induced transdifferentiation of HK-2cells in vitro.Spironolactone inhibits this process in a dose-dependent manner.TGF-β1/Smads signaling pathway may be play an important role in this process.
spironolactone;kidney tubules;epithelial cells;cell differentiation;transforming growth factor beta
10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.005
A
1671-8348(2012)18-1799-03
* 基金项目:江西省卫生厅科技计划(20121077)｡△
;Tel:(0791)86291976;E-mail:tuweiping6102@sina.com｡
2012-01-09
2012-03-02)
•基础研究•
