罗海波，吕爱贞，卢 晓，富 宁，吴 砂，郑 华

（1.广州军区解放军第421医院检验输血科，广州510310；2.南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广州510515；3.南方医科大学南方医院心内科，广州510515）

心血管狭窄引起的冠心病已经成为危及人类生命健康的主要疾病之一，向病变血管内置入金属支架，成为目前治疗冠状动脉及其他外周动脉疾病有效的治疗方法［1］。目前常用的材料有钽、医用不锈钢及镍钛合金等。近年来发现，这些金属材料支架会影响单核巨噬细胞功能，引发过敏反应［2］。但对单核巨噬细胞其他功能的影响却未做深入研究。

单核巨噬细胞的重要功能之一就是抗感染，通过多种方式能识别多种病原微生物关键成分，从而发挥清除病原微生物的目的。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，对细胞的生长与持续极为重要，单核巨噬细胞通过其表面Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）－LPS识别革兰阴性菌，诱发一系列的炎性反应及免疫应答［3］。本研究利用镍钛合金心血管支架（nickel－titanium stent，NTS）作用单核巨噬细胞系Raw264.7细胞，检查其影响单核巨噬细胞应答LPS的能力及其胞内炎症相关的信号通路改变，从而探讨NTS对单核巨噬细胞抗感染能力，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 PE标记抗小鼠FasL、CD80、CD86抗体均购自美国Biolegend公司。小鼠IL－6、TNF－α的ELISA试剂盒均购自美国Biolegend公司。LPS购自美国Sigma公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。Luciferase Assay购自美国Promega公司。pGL4.32－luc2P／NF－κκB－RE／Hygro Vector购自美国Promega公司。干扰素－γ（GAS）、干扰素刺激反应元件（ISRE）、信号转导与转录活化因子（STAT3）信号通路质粒均购自美国Clontech公司。不完全培养基RPMI－1640及新生小牛血清均购自美国Gibco公司。胰蛋白酶购自广州威佳科技有限公司。NTS为荷兰Orbusneich公司产品。

1.2 方法

1.2.1 单核巨噬细胞培养 Raw264.7细胞用含10%新生小牛血清的完全培养基RPMI－1640在37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.2.2 地塞米松（DX）刺激Raw264.7细胞 于Raw264.7细胞中加入10－6mol／L DX培养4d（DX－Raw264.7细胞）。

1.2.3 NTS刺激Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞 调整细胞密度为1×106／mL，于培养的Raw264.7细胞及DXRaw264.7细胞中加入NTS培养4d。

1.2.4 LPS刺激经支架作用后的Raw264.7细胞及DXRaw264.7细胞 于经NTS作用后的Raw264.7细胞及DXRaw264.7细胞中加入LPS培养24h，收集细胞培养上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍待检。

1.2.5 流式细胞仪检测 调整细胞密度为1×106／mL，分别标记抗体PE－FasL、PE－CD80。4℃孵育30min，PBS洗2遍，加入0.5mL PBS重悬，流式细胞仪进行分析。

1.2.6 细胞因子检测 根据小鼠IL－6、TNF－α的ELISA试剂盒说明书检测Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞培养上清液中IL－6和 TNF－α。

1.2.7 信号通路活化检测 铺板，将每孔的细胞密度调整为1×105／mL，按Lipofectamine 2000说明书将pGL4.32［luc2P／NF－κκB－RE／Hygro］Vector、pTA－GAS－luc、pTA－ISRE－luc和pTA－STAT3－luc信号通路活化质粒转染各组Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞，24h后收集细胞裂解液，荧光素酶试剂盒进行检测。

1.2.8 根据不同处理方式分组 分为：对照空白组，单纯NTS组，单纯LPS作用组，NTS作用后LPS反应组，RAW264.7组：单核细胞系264.7，DX－Raw264.7组：DX作用单核细胞系。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，所用的统计学方法为t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NTS作用后LPS对Raw264.7及DX－Raw264.7细胞表面共刺激分子的影响 NTS作用后经过LPS刺激时，Raw264.7细胞CD80的表达明显高于LPS单独刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而DX预处理组，NTS影响差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 NTS作用后LPS对Raw264.7及DX－Raw264.7细胞表达CD80的影响

2.2 NTS作用后LPS对单核巨噬细胞Raw264.7合成促炎症因子的影响 在NTS单独作用下，Raw264.7组分泌IL－6及TNF－α明显高于空白对照组，但经NTS作用后，应对LPS刺激时Raw264.7组分泌IL－6明显低于LPS单独刺激组。但Raw264.7组经过DX事先处理后，各组IL－6的分泌差异无统计学意义（P＞0.05），而且NTS与LPS对单核巨噬细胞的影响都明显受到了抑制，弱于Raw264.7组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 NTS作用后LPS对Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞分泌IL－6及TNF－α的影响

2.3 NTS作用后LPS对单核巨噬细胞Raw264.7细胞表面FasL类分子表达的影响 经NTS作用后，LPS诱导的Raw264.7细胞FasL的表达明显低于LPS单独刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05）。但Raw264.7细胞经过DX事先处理后，DX－Raw264.7细胞经NTS单独刺激后，FasL的表达明显低于空白对照组，经LPS单独刺激后，FasL的表达明显高于空白对照组，而低于NTS与LPS共同刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在LPS单独刺激下，DX－Raw264.7组表面FasL的表达明显高于Raw264.7组，在NTS与LPS共同刺激下，DX－Raw264.7组表面FasL的表达同样明显高于Raw264.7组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 NTS作用后LPS对Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞表达FasL的影响

图4 NTS作用后LPS对Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞胞内NF－κB信号通路活化的影响

图5 NTS作用后LPS对Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞胞内GAS信号通路活化的影响

图7 NTS作用后LPS对Raw264.7细胞及DX－Raw264.7细胞胞内STAT3信号通路活化的影响

2.4 NTS作用对Raw264.7细胞信号通路的影响。NTS作用后，明显抑制LPS对NF－κB的活化作用，但LPS介导的GAS，ISRE及STAT3等通路无明显影响。但Raw264.7细胞经过DX事先处理后，NTS单独就可活化 NF－κB、GAS、ISRE及STAT3等一系列信号通路，但镍钛合金影响LPS介导的信号活化，DX－Raw264.7组与Raw264.7组差异有统计学意义（P＜0.05），见图4～7。

3 讨 论

动脉粥样硬化是心血管疾病死亡的重要原因之一，目前主要是通过向动脉狭窄部位植入金属支架，使病变部位动脉保持血流畅通以达到治疗疾病的目的［4］。然而，金属支架作为一种外来异物，植入人体后会引起机体免疫功能发生改变。现已证实，金属支架植入后，虽然通过机械张力短时间内改变血管狭窄，但由于金属支架可刺激机体免疫细胞应答，局部形成炎性反应，造成支架周边血管床炎症，容易形成再狭窄，严重地影响了支架的作用［5］。对于支架材料的选择与应用一直是一个难题。在本研究中，证实了在NTS单纯作用下，基本上不引发单核巨噬细胞炎症信号通路的活化，不产生炎症因子，这点有利于进行术后恢复，这与文献报道的镍钛合金支架作用处出现过敏性炎症不同，由此似乎可以得到一种比较好的低免疫原性支架材料配比［6］。

单核巨噬细胞作为重要的吞噬细胞，对革兰阴性菌的吞噬处理是其重要的免疫功能。LPS是革兰阴性菌重要的胞壁组成成分，能与单核巨噬细胞表面TLR4分子结合，刺激免疫反应的发生。在哺乳动物体内，TLR4是LPS最主要的识别受体［7］。LPS从细菌中释放出来后，会与血液中的LPS结合蛋白（LBP）结合，再与巨噬细胞表面的甘油磷酸肌醇结合蛋白CD14结合，接着LPS被转移到TLR4胞外段 MD－2上，刺激巨噬细胞，使其发生一系列的反应［2］。本研究着重观察镍钛合金影响单核巨噬细胞对LPS应答的影响，结果证实，NTS作用后，单核巨噬细胞应答LPS时，其表面的杀伤性标志FasL及促炎症因子IL－6的表达都明显低于无支架作用时，说明NTS抑制了Raw264.7细胞对LPS的免疫应答，表明NTS可能会抑制单核巨噬细胞对革兰阴性菌的应答。对于单核巨噬细胞，当其通过TLR4与LPS结合后，会活化巨噬细胞内的NF－κB通路［8］。分泌多种促炎症细胞因子，如IL－6、TNF－α等，引起一系列的炎性反应［9－10］。而镍钛合金明显地抑制了这种LPS介导的NF－κB活化，降低了炎性反应。除此以外，对于感染，干扰素也是重要的抵抗因素，笔者关注了GAS或ISRE，这两种与干扰素产生密切相关的信号通路的活化严格控制了干扰素的产生［11］，本研究中发现他们都没受到影响，由此证实镍钛合金无法影响Ⅰ型及Ⅱ型干扰素的产生。

DX为糖皮质激素的一种，具有抗炎、抗过敏等多种药理作用，被临床广泛使用，在避免支架植入后狭窄中经常使用，现在已经将缓释DX涂层应用于支架的报道减轻局部炎性反应［12］。在本研究中，DX可以明显改变NTS的作用。DX单独作用就可以明显降低促炎症因子及相关炎症信号分子的活化，而镍钛合金对LPS介导的NF－κb活化的抑制效应也得到了放大，同时还影响了ISRE及STAT3信号的活化，进一步地抑制了抗炎作用。所以，DX在支架干扰LPS应答方面会加强这种抑制效果，使机体更难应答LPS。

综上所述，NTS可通过抑制单核巨噬细胞NF－κB活化阻碍LPS的免疫应答，而DX则会进一步放大这种抑制效应。此研究有利于从临床应用角度探讨NTS的应用。

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