康利民，潘明新，高 毅，王康华，洪 合

（南方医科大学珠江医院肝胆二科，广州510280）

重症急性胰腺炎（server acute pancreatitis，SAP）的死亡高峰主要是坏死的胰腺组织引起的继发感染。继发感染主要源于SAP肠黏膜屏障破坏引起的细菌易位［1］。动物及临床研究已经证实，肠内营养（enteral nutrition，EN）支持对SAP肠屏障功能的保护作用［2－3］。肠内免疫微生态营养（ecoimmunonutrition，EIN）支持是近年来发展起来的一种新方式，本实验探讨EIN对SAP大鼠肠黏膜屏障的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠60只（购自南方医科大学实验动物中心），体质量260～300g，分为对照组、EN组和EIN组，每组20只。采用逆行胰胆管缓慢注入4%牛黄胆酸钠1mL／kg体质量的方法制备SAP模型，对照组开腹后翻动胰腺数次。SAP模型大鼠另选取空肠起始部约2 cm以下行空肠造口置入造瘘管并经皮下隧道引出体外。

1.2 方法

1.2.1 方法 EN组：待大鼠清醒后4h，用少量等渗盐水冲洗肠管，6h起肠道滴注肠内营养乳剂（华瑞公司生产），各组大鼠能量摄入126kJ·kg－1·d－1。EIN组：在EN组肠内营养乳剂中加入谷氨酰胺（L－Gln，成都药业股份有限公司）0.4g·kg－1·d－1、精氨酸（L－Arg，上海信谊制药厂）0.25g·kg－1·d－1、三联活菌制剂（双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及肠球菌，上海信谊制药厂）109CFU／d。对照组正常饮食、饮水。3组大鼠7d后经腹腔麻醉处死，心脏取血备用。取胰腺、空肠甲醛及戊二醛固定保存备用。

1.2.2 检测指标及方法 血清淀粉酶采用全自动生化仪测定；血浆内毒素测定采用动态比浊法，内毒素检测用水购自天津一瑞生物工程有限公司；D－乳酸采用酶学分光光度法检测，D－乳酸标准液及右旋乳酸脱氢酶（D－LDH）购自Sigma公司；二胺氧化酶（DAO）采用活性比色法测定，检测试剂盒购自上海杰美基因医药有限公司；取胰腺及距幽门10cm处小肠约2 cm，常规甲醛固定光镜病理检查，测20个小肠绒毛的绒毛高度并计算小肠黏膜厚度。参照文献［4］将小肠黏膜损伤分为6级，比较3组小肠病理学评分；另取约2cm小肠，2.5%戊二醛溶液固定并乙醇脱水，环氧树脂包埋，亚甲蓝染色光镜下定位后，醋酸铀、柠檬酸铅染色，JEM－200EX（JEOL公司）透射电镜下观察并摄片。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物存活情况 实验过程中，EN组有3只大鼠分别于术后45min、16h、4d死亡，EIN组1只大鼠于术后3d死亡，以上4只大鼠实验数据未进入统计。

2.2 血清淀粉酶、内毒素、D－乳酸及DAO水平变化EN组、EIN组血清淀粉酶、内毒素、D－乳酸及DAO水平均明显高于对照组（P＜0.01）；EIN组内毒素、D－乳酸及DAO水平较EN组明显降低（P＜0.01或P＜0.05），两组血清淀粉酶无明显差异，见表1。

2.3 胰腺和小肠组织病理学变化 对照组胰腺小叶结构完整无明显改变；EN组胰腺组织出血、坏死，腺体结构消失，炎性细胞浸润和胰周组织脂肪坏死；EIN组可见胰腺小叶结构欠完整，轻度水肿、出血，组织间隙略增宽，少量炎性细胞浸润（图1）；对照组空肠黏膜完整，空肠绒毛无水肿，排列整齐；EN组空肠黏膜上皮糜烂，大片坏死，脱落及缺损，大量炎症细胞浸润，绒毛样结构减少；EIN组空肠黏膜表现轻度水肿，片状坏死，绒毛部分脱落及倒伏，见图2。

表1 血清淀粉酶、内毒素、D－乳酸及DAO水平比较±s）

表1 血清淀粉酶、内毒素、D－乳酸及DAO水平比较±s）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与 EN 组比较。

组别 n 淀粉酶（IU／L）内毒素（pg／L）D－乳酸（μg／mL）DAO（μg／mL）150±35 7.91±2.13 3.94±1.17 14.27±2.53 EN组 17 1 629±91a41.45±3.27a11.35±1.34a81.27±3.46a EIN组 19 1 521±87a18.57±2.51ab 6.64±1.47ab 21.67±6.72对照组 20 ac

图1 各组大鼠胰腺病理学变化（HE×100）

图2 各组大鼠肠道病理学变化（HE×100）

2.4 小肠黏膜厚度、绒毛高度及肠上皮损伤指数的变化 EN组、EIN组大鼠小肠黏膜厚度和绒毛高度均较对照组明显降低（P＜0.01），小肠上皮损伤指数较对照组明显增加（P＜0.01）；EIN组小肠黏膜厚度和绒毛高度较EN组显着增加（P＜0.05或P＜0.01），而小肠上皮损伤指数较EN组明显减低（P＜0.01），见表2。

表2 小肠黏膜厚度、绒毛高度计肠上皮损伤指数比较±s）

表2 小肠黏膜厚度、绒毛高度计肠上皮损伤指数比较±s）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与 EN 组比较。

组别 n 黏膜厚度（μm） 绒毛高度（μm）20 669.78±63.51 37.29±5.92 0.82±0.31 EN组 17 369.37±28.52a16.43±4.73a 3.95±0.74a EIN组 19 486.30±37.28ab 21.47±3.60ac 2.81±0.36肠上皮损伤指数对照组ab

图3 各组大鼠肠道电镜变化（×10 000）

2.5 小肠组织电镜结构变化 电镜观察下对照组小肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列整齐，柱状上皮细胞结构完整，细胞质内细胞器丰富，结构未见异常，固有层腺体结构及各种细胞结构正常；EN组小肠黏膜线粒体高度肿胀，嵴缺失，内质网肿胀，上皮细胞微绒毛稀疏、部分缺如，细胞萎缩，大量细胞核浓缩，染色质边聚；EIN组小肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列有轻度线粒体、内质网肿胀，上皮细胞微绒毛排列略不规整，见图3。

3 讨 论

近年来的研究表明，肠道不仅是消化吸收的重要场所，同时也是急性应激反应的中心器官及多器官功能衰竭的始动器管［5］。肠道作为体内最大的细菌和内毒素库，肠黏膜屏障功能的完整性对抵抗肠源性细菌易位具有重要的作用。肠道细菌易位导致的胰腺坏死继发感染是SAP的主要死因之一。所以探索维持肠道黏膜结构和功能的有效方法是目前SAP研究的热点之一。

肠黏膜屏障主要由机械屏障、免疫屏障、生物屏障及化学屏障4部分组成，而肠黏膜通透性是评价肠黏膜屏障功能的重要指标。刘中辉等［6］研究发现，SAP早期的肠黏膜破坏导致肠道通透性明显增加。本实验结果发现，与对照组比较，EN及EIN组小肠黏膜厚度、绒毛高度及肠上皮损伤指数均有差异，亦证明SAP大鼠小肠存在肠道黏膜的损伤，然EIN组大鼠小肠的空肠光镜变化、病理学评分及电镜超微结构改变均较EN组轻微，提示应用肠内免疫微生态营养能较有效保护肠道，维护肠道黏膜屏障的完整性。

EIN是在普通EN的基础上添加将谷氨酰胺、精氨酸、益生菌等有免疫促进及调节肠道菌群失调的特殊营养素。动物及临床实验表明，EIN可通过不同机制协助保护肠黏膜屏障［7］，抑制肠道菌群失调，减轻全身炎性反应，提高机体免疫，降低SAP的感染率［8－10］。D－乳酸是细菌发酵的代谢产物，当肠道通透性增加时肠道中细菌产生大量D－乳酸通过受损黏膜入血使血浆D－乳酸水平升高，故检测血浆D－乳酸水平可及时反映肠壁通透性变化［11］。DAO是肠黏膜上层绒毛细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶，在肠黏膜细胞受损、坏死后该酶释放入血或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内，可通过测定其在外周血中变化，作为反映肠黏膜完整性相对稳定的生化指标［12］。

本实验发现，EN组及EIN组血清内毒素、D－乳酸及DAO水平均增高，说明SAP时存在内毒素血症、肠道通透性增高。而EIN组血清内毒素、D－乳酸及DAO水平明显低于EN组（P＜0.01或P＜0.05），提示应用EIN能有效保护肠道，减少肠道的通透性，维护肠黏膜屏障的完整性，降低SAP大鼠内毒素血症。

综上所述，本实验通过多角度、多指标的研究，论证了EIN对SAP大鼠具有降低空肠的通透性，减少菌群移位，有助于对肠屏障功能的保护作用。当然其具体作用方式及机制还需进一步深入地研究。

［1］蔡笃雄，陈卫昌，曾仕平，等.乙酰半胱氨酸及氢化可的松对重症急性胰腺炎治疗作用的实验研究［J］.重庆医学，2010，39（2）：137－139.

［2］汪洁，马保金，蔡端，等.急性坏死性胰腺炎大鼠肠道黏膜屏障功能的损害及肠道细菌移位［J］.中华实验外科杂志，2007，24（5）：570－572.

［3］Ong JP，Fock KM.Nutritional support in acute pancreati－tis［J］J Dig Dis，2012，13（9）：445－452.

［4］Nieuwenhuijzen GA，Haskel Y，Lu Q，et al.Macrophage elimination increases bacterial translocation and gut－origin septicemia but attenuates symptoms and mortality rate in a model of systemic inflammation［J］.Ann Surg，1993，218（6）：791－799.

［5］邹忠东，张再重，王瑜，等.N－乙酰半胱氨酸对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能与二次打击的保护作用［J］.中华实验外科杂志，2009，26（2）：64－66.

［6］刘中辉，杜艳平，李初俊，等.生态免疫肠内营养对重症胰腺炎大鼠肠屏障功能和胰腺炎症的影响［J］.中华临床营养杂志，2010，18（2）：106－110.

［7］陈明，李涛，曾贵利，等.渐进性联合营养支持治疗在重症急性胰腺炎中的作用［J］.重庆医学，2010，39（6）：672－674.

［8］吴丹，戴洪银，汪小燕.不同早期营养支持疗法治疗重症急性胰腺炎的疗效比较［J］.重庆医学，2011，40（18）：1834－1836.

［9］Bertolini G，Luciani D，Biolo G.Immuonutrition in septic patients：aphilosophical view of the cuttent situation［J］.Clin Nutr，2007，26（1）：25－29.

［10］童智慧，李维勤，虞文魁，等.早期肠内营养添加谷氨酰胺对重症急性胰腺炎炎症反应和免疫功能的影响［J］.肠外与肠内营养，2009，16（5）：264－268.

［11］Lord RS，Bralley JA.Clinical applications of urinary organic acida.part 2.Dysbiosis markers［J］.Altern Med Rev，2008，13（4）：292－306.

［12］林敏，陈卫昌，薛乐宁，等.Toll样受体4在猪急性坏死性胰腺炎肠道组织中的表达及其意义［J］.世界华人消化杂志，2012，20（15）：1338－1341.