邓世康，袁 珺，王连敏，王 滔，邹 浩，张小文

（昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科二病区，昆明 650101）

胆囊上皮细胞和胆管上皮细胞一样，是一种高氧耗、高代谢、低缺氧耐受的细胞群体，由于胆囊上皮细胞这些特殊的生物学特征，使其体外培养很困难。通过创新培养方法后成功培养出了人胆囊上皮细胞（human gallbladder epithelial cells，HGBECs），不仅能使其存活时间延长，还能维持其生物学特征。胆囊结石、胆囊息肉和胆囊癌等胆囊疾病的发病都与胆囊上皮细胞密切相关，研究胆囊上皮细胞，可以更为准确了解胆囊疾病乃至胆管疾病的发病机制、诊断和治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人胆囊标本 标本来源于昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科二病区经手术治疗胆囊息肉的患者，并且经院伦理委员会及患者同意。

1.1.2 试剂（1）完全培养基Ⅰ：DMEM／F12培养基（Hyclon公司）中加入20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco公司），1%青／链霉素（双抗）（索莱宝公司）。（2）完全培养基Ⅱ：DMEM／F12培养基中加入10ng／mL表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF，PeproTech公司），20%FBS，1%双抗。（3）完全培养基Ⅲ：DMEM／F12培养基中加入10ng／mL EGF（PeproTeeh公司），10ng／mL 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF，PeproTech公司），20%FBS，1%双抗。Ⅳ型胶原酶（索莱宝公司），胰酶（索莱宝公司），DNase I（索莱宝公司），纤维连接蛋白（Pro Specbio公司），细胞角蛋白19抗体（Epitomics公司），荧光二抗（KPL公司），噻唑蓝（MTT，索莱宝公司）。

1.2 方法

1.2.1 HGBECs的分离、纯化与培养 取下患者胆囊，避开息肉部位切取约2cm×2cm胆囊组织，生理盐水冲洗3遍。用预冷的含1%双抗的PBS冲洗3遍。将组织转移至盛有预冷DMEM／F12培养基的60mm培养皿中，剥取上皮。将上皮转移至35mm培养皿（1号）中，加入预温的Ⅳ型胶原酶（含20 μ／mL DNase I）2mL将整个上皮组织浸泡，37℃消化30min，每10min振荡1次。将组织转移至35mm培养皿（2号）中，用手术刀片反复刮取上皮，用DMEM／F12培养基冲洗组织后，再将组织放回1号培养皿中继续消化30min，如此反复3次。将2号培养皿中的液体用吸头吹打10多次后，200目不锈钢筛网过滤细胞悬液。800r／min离心5min，弃上清液，沉淀重悬于DMEM／Fl2培养基中，再次800r／min离心5min，弃上清液，沉淀重悬于含20%FBS的DMEM／Fl2培养基中，接种到60mm的培养皿中，37℃培养1h。轻轻吸取培养基，800r／min离心5min，弃上清液，沉淀分别重悬于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培养基中。台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞浓度至（1～3）×106／mL接种于12孔培养板中用纤维连接蛋白包被好的细胞爬片上，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后换液，以后每2～3d换液1次。每天用倒置显微镜观察细胞形态及其生长的基本情况。

1.2.2 培养细胞的免疫荧光化学鉴定 细胞培养6d后，吸弃培养液；PBS漂洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定15 min；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；3%胎牛血清清蛋白封闭1h；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶250稀释的一抗（兔抗人多克隆抗体），4℃过夜；含0.03%Triton的PBS漂洗3次，每次5min；滴加1∶1 000稀释的荧光二抗（羊抗兔），避光孵育30min；避光PBS漂洗3次，每次5min；含0.5μg／mL DAPI的封片液封片。阴性对照组用含0.03%Triton的PBS代替一抗。

1.2.3 细胞分组、测量存活时间和细胞计数 （1）细胞分组：根据添加生长因子的不同，将细胞分为未添加细胞因子组、添加EGF组、添加EGF＋HGF组。（2）测量细胞存活时间：以细胞开始出现空泡当天为存活的最后1d，测量每组12孔细胞的存活时间。（3）细胞计数：分别于培养第3～10天从每组中随机抽取3孔，每孔在20倍镜下采集3个视野；计数每个视野中上皮细胞的数目。

1.2.4 MTT法测定细胞活力 将细胞以每孔1×104个细胞接种于纤维连接蛋白包被的96孔培养板中，分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全培养基培养。分别于培养第3～10天后加入MTT溶液20μL，37℃培养箱中维持4h，小心吸弃孔内培养基，每孔加入150μL DMSO，振荡10min后，酶标仪在波长570nm处测定OD值。每组设3复孔，重复3次，以不加细胞只加培养基的孔为空白对照孔。以时间为横轴，吸光度值均值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学处理 所有实验数据用SPSS17.0统计软件包进行处理，数据以表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态和生长特性 原代培养的胆囊上皮细胞接种1 d可见细胞贴壁，3组细胞在3d时形态相似，即成大小不等的“细胞岛”（图1A）。未添加细胞因子组细胞形态呈锥形，生长缓慢，6d左右细胞间连接松散（图1B），至9d左右细胞出现拉丝现象，细胞质内出现大小不等的空泡，细胞变大逐渐死亡（图1C），平均存活时间为（10.3±2.2）d。添加EGF组细胞形态在6d时形成多边形或者锥形并形成较大的“细胞岛”（图1D），生长较未添加细胞因子组快，细胞数量增多，9d左右“细胞岛”逐渐扩大（图1E），细胞间连接也比未添加细胞因子组紧密，12d左右细胞间连接开始松散，细胞形态接近多边形（图1F），平均存活时间为（14.2±2.4）d。与未添加细胞因子组相比，存活时间明显延长，差异有统计学意义（P＜0.001）。EGF＋HGF组细胞形态在6d左右近似多边形，细胞排列紧密，呈典型的“铺路石”状生长（图1G、H），细胞增殖快，立体感强，细胞密度加大，此时细胞生长状态最佳，9d时细胞继续生长（图1I），18d左右细胞形态开始由多边形变成梭形，细胞间隙加大（图1J），21d左右细胞出现空泡并逐渐死亡，平均存活时间为（19.3±2.5）d。与添加EGF组比较，存活时间显着延长，差异有统计学意义（P＜0.001），EGF联合HGF培养更能长时间维持胆囊上皮细胞的形态。

图1 各组细胞不同培养时间的生长情况

2.2 细胞鉴定 细胞角蛋白19（cytokeratin－19，CK－19）是胆管上皮细胞的特异性标志物，肝细胞和成纤维细胞均不表达，可用于鉴定胆管上皮细胞。荧光染色后可见细胞呈多边形，细胞间紧密连接，细胞核呈椭圆形位于细胞质中央（图2）。

2.3 细胞计数结果 统计结果显示，培养3d和4d时，细胞计数3组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。培养5～10d，添加HGF＋EGF组细胞数量明显多于添加EGF组，添加EGF组明显多于未添加细胞因子组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。未添加细胞因子组细胞在培养第5～8天生长活跃，第9天后生长减慢；添加EGF组细胞第5～8天增殖快，第9天后进入平台期，衰减趋势低于未添加细胞因子组；添加HGF＋EGF组细胞至第10天增殖仍然迅速，生长旺盛，与未添加细胞因子组和添加EGF组比较具有较好的生长优势，见图3。

图2 人胆囊上皮细胞CK－19鉴定（×630）

2.4 MTT检测结果 结果显示，培养3d和4d时，3组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。培养5d时，与未添加细胞因子组比较，添加EGF组细胞活力没有明显增强，差异无统计学意义（P＞0.05）；与添加EGF组细胞比较，添加HGF＋EGF组细胞活力明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。培养6～10d，添加HGF＋EGF组细胞活力显着高于其他两组，其活力在培养8d时下降，但幅度缓慢，添加EGF组细胞活力优于未添加细胞因子组，差异均有统计学意义（表2）。未添加细胞因子组细胞在培养第4～6天活力上升，第9天后迅速衰减；添加EGF组细胞第4～7天增殖快，之后进入平台期，第9天后逐渐减低，衰减趋势低于未添加细胞因子组；添加HGF＋EGF组细胞在第9天活力最强，之后逐渐衰减，与未添加细胞因子组和添加EGF组比较，能较长时间维持细胞活力（图4）。

图3 3组细胞培养生长情况

表1 各组人胆囊上皮细胞计数比较s，n＝3）

表1 各组人胆囊上皮细胞计数比较s，n＝3）

＊：P＜0.05，与未添加细胞因子组比较；▲：P＜0.05，与添加EGF组比较；＃：P＜0.001，3组间两两比较；◆：P＜0.001，与未添加细胞因子组和添加EGF组分别比较。

培养时间组别3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加细胞因子组 5.6±2.1 9.7±3.2 16.0±3.0 30.3±1.5＃ 49.3±3.1 69.7±4.9 71.3±8.1 46.0±4.4＃添加EGF组 6.3±3.1 10.7±4.5 26.0±3.7＊ 53.3±4.7＃ 87.3±3.1＊ 108.7±5.5＊ 125.0±11.0＊ 131.0±17.1＃添加EGF＋HGF组 5.0±1.2 11.0±4.6 35.3±2.1＊▲ 76.3±4.0＃ 129.3±12.0◆ 171.7±12.1◆ 213.0±10.1◆ 248.0±4.6＃

表2 MTT检测各组人胆囊上皮细胞活力±s，n＝3）

表2 MTT检测各组人胆囊上皮细胞活力±s，n＝3）

＊：P＜0.05，与未添加细胞因子组比较；▲：P＜0.05，与添加EGF组比较；＃：P＜0.001，与未添加细胞因子组比较。

培养时间组别3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d未添加细胞因子组 0.254±0.093 0.297±0.084 0.423±0.075 0.513±0.113 0.522±0.054 0.504±0.087 0.453±0.087 0.285±0.121添加EGF组 0.247±0.132 0.287±0.077 0.442±0.088 0.574±0.045＊ 0.633±0.057＊ 0.626±0.056＊ 0.586±0.097＊ 0.493±0.110＊＃添加EGF＋HGF组 0.256±0.110 0.307±0.067 0.538±0.079▲ 0.726±0.077▲＃0.744±0.048▲＃0.716±0.046▲＃0.697±0.076▲＃0.643±0.098▲＃

图4 3组细胞MTT检测情况

3 讨 论

本实验在Joplin等［1－4］研究的基础上改良了胆囊上皮细胞的培养方法，成功培养胆囊上皮细胞，并能稳定维持19d左右。在培养方法上有较多创新，如本实验首次采用首先剥离上皮的方法，可以最大幅度减少其他细胞，尤其是纤维细胞的污染，得到的细胞纯度较高；由于胆管上皮细胞仅占肝细胞总数的3%～5%，采用反复酶消化和刮取上皮组织，这样可以收集到较多上皮细胞；加入EGF和HGF，同时把胎牛血清浓度提高到20%，以满足胆囊上皮细胞特殊的生物学特性。本实验方法的建立能够有效地为肝胆疾病的研究提供技术支撑。

CK属于中间纤维蛋白家族，是细胞骨架的构成部分，CK－19只在胆管肿瘤细胞、胆管上皮细胞及其祖细胞中表达，在肝细胞、肝干细胞及肝肿瘤细胞中不表达，因此CK－19是目前公认的胆管上皮细胞的特征性标记物［5］。

EGF是细胞培养中常用的添加剂，国内外文献报道［6－8］在肝内外胆管上皮细胞培养中绝大多数都使用了EGF，因其能够促进肝细胞和胆管上皮细胞的增殖［9－10］。

HGF是成熟肝细胞DNA合成最强的刺激因子和肝损伤后再生的激发因子，是肝非实质细胞的一种有效促分裂剂［11］。HGF广泛分布于肝脏各种细胞，肿瘤细胞等多种细胞中。HGF具有许多生物学功能，但对肝细胞的作用最为显着，表现在HGF可以抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞再生，恢复肝细胞功能。HGF可通过抑制转化生长因子的表达从而抑制了肝［12］、肾［13］、肺［14］等器官的纤维化过程。目前知道 HGF能促进胆管上皮细胞增殖，但HGF与胆囊、胆管关系的研究并不多见。有学者联合应用HGF和EGF成功地分别将胚胎干细胞［15］和骨髓间充质干细胞［16］诱导向胆管上皮样细胞分化，HGF联合EGF能诱导干细胞向胆管上皮样细胞分化，说明在胆管上皮细胞的发生、生长、存活乃至结构和功能上，HGF和EGF发挥着协同促进的作用。因此，笔者联合应用HGF和EGF培养人胆囊上皮细胞，发现联合组细胞存活时间（19.3±2.5）d比只用EGF培养的细胞存活时间（14.2±2.4）d长5d左右，细胞活力强，能较长时间维持细胞间的紧密连接和典型的“铺路石”状态，尽管HGF＋EGF组细胞活力在8d时下降，但幅度比EGF组和无细胞因子组缓慢，而且HGF＋EGF组细胞在8d以后仍然持续增殖，说明HGF对胆囊上皮细胞的存活和生长具有促进作用。笔者通过创新和改良了人胆囊上皮细胞的培养方法，显着促进其增殖，延长其体外存活时间和形态特征。这种新方法的建立将为未来肝胆细胞的研究提供坚实基础。

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