秦树森，杨 柯，曾春晖，谭娥玉，蔡妮娜，陈益清，颜 欣，徐明光
（1.广西中医药大学药学院，南宁530001；2.广西壮族自治区桂林市妇女儿童医院药剂科 541001）
飞机草（Eupatorium odoratum L）性微辛、温，有小毒，具有散瘀消肿，止血，杀虫功能，民间主要用于治疗跌打肿痛，外伤出血，疮疡肿毒等[1]。在2003年国家环境保护局公布危害我国最严重的16种外来入侵物种中，飞机草危害程度名列第7位，这在一定程度上反映飞机草植物资源具有异常丰富的特点。前期研究也表明飞机草对冰醋酸和热致痛有明显镇痛作用[2]。本文对其镇痛部位及其可能的作用机制进行研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 2011年8月于南宁市郊采集飞机草，经广西中医药大学中药学教研室冼寒梅教授鉴定为菊科植物飞机草的地上部分。盐酸哌替啶（湖北宜昌制药厂）；阿司匹林（石家庄永强制药厂）；纳络酮（北京四环制药厂）；青霉素[中诺药业（石家庄）有限公司]；链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）；冰醋酸（上海国药集团化学试剂有限公司）；前列腺素E2（PGE2）试剂盒和NO试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 主要仪器 全波长酶标仪（Epoch Biotek公司，美国）；超声匀浆器（宁波新芝科技研究所）；TGL-16B型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；YLS-6B智能热板仪（山东省医学科学院设备站）；WSZ-261-79恒温水浴箱（上海医疗器械一厂）；秒表（上海禾汽玻璃仪器有限公司）
1.1.3 实验动物 昆明小鼠，雌雄各半，体质量22～26g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物证号SCXK（桂）2009-0003。
1.2 方法
1.2.1 受试药物制备 采集新鲜飞机草地上部分，洗净，阴干，水提取2次。第1次10倍量水，提取1h，过滤。第2次8倍量水，提取0.5h，过滤，合并滤液，适当浓缩，醇沉过夜，抽滤后浓度为5g／mL，4℃冰箱放置备用。
1.2.2 脊髓化小鼠甩尾实验[3-4]
1.2.2.1 动物筛选 取昆明种小鼠150只，雄性，体质量（20±2）g，筛选前在小鼠鼠尾尖部2cm处标记，将这一部位尾端浸入50℃温水浴中进行药前痛阈值测试和筛选，以鼠尾回缩出水面的时间为测痛指标，剔除痛阈值小于3s，大于15s的小鼠。
1.2.2.2 脊髓化小鼠制备 挑选正常痛阈值合格的120只小鼠，用0.4%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，于胸椎6～8处剪开皮肤分离组织，除去椎板，暴露出脊髓后切除约1mm脊髓，随即缝合皮肤，术后给予适量抗菌药物抗感染。脊髓化合格的要求是小鼠无感染且后肢无爬行行为。
1.2.2.3 正式实验 挑选合格的脊髓化小鼠90只，按脊髓化手术前测得的痛阈值随机均分为6组，每组15只，即空白对照组（蒸馏水）、模型对照组（蒸馏水），阳性对照组（阿司匹林200 mg／kg）、飞机草高、中、低剂量组（40、20、10g／kg），灌胃，给予相应药物，1次／天，连续给药3d，给药容量20mL／kg，空白对照组、模型对照组给予等量蒸馏水。末次给药前小鼠禁食不禁水12h，末次给药后1h，在小鼠鼠尾尖部2cm处标记，将这一部位尾端浸入50℃温水浴中，以鼠尾回缩出水面的时间作为测痛指标。
1.2.3 福尔马林致炎性疼痛实验[5]取昆明种小鼠60只，雄性，体质量（20±2）g，随机分为6组，即模型对照组（蒸馏水）、阳性对照组Ⅰ（盐酸哌替啶40mg／kg）、阳性对照组Ⅱ（阿司匹林200mg／kg），飞机草高、中、低剂量组（40、20、10g／kg），每组10只，给予相应药物，给药容量20mL／kg，1次／天，连续给药3d，模型对照组给予等量的蒸馏水。末次给药前小鼠禁食不禁水12h，末次给药后1h，于各组小鼠左后肢足跖部皮下注射1%的福尔马林溶液10μL／只后，立即置入悬挂于铁支架上的5 000mL的烧杯内，通过烧杯下方倾斜30°镜面观察大鼠足部的反应，分别观察记录注射0～10min（早期相）及10～30min（晚期相）的疼痛反应评分，3分：舔、咬、抖足；2分：提足；1分：跛行；0分：行走自如。按下列公式计算各组疼痛反应积分：疼痛反应积分＝（0t1＋1t2＋2t3＋3t4）／（t1＋t2＋t3＋t4），t1、t2、t3、t4分别为0、1、2、3分时持续的时间（s），数据做统计 学处理。
1.2.4 纳洛酮阻断实验[3，6]
1.2.4.1 冰醋酸扭体实验 取昆明种小鼠90只，雄性，体质量（20±2）g，随机分为6组，即模型对照组（蒸馏水）、阴性对照组（纳络酮5mg／kg）、阳性对照组（盐酸哌替啶40mg／kg）、飞机草高、中、低剂量（40、20、10g／kg）组，每组15只，给予相应药物，给药容量20mL／kg，1次／天，连续给药3d，模型对照组和阴性对照组给予等量的蒸馏水。末次给药前小鼠禁食不禁水12h，末次给药后1h，除模型对照组小鼠皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠皮下注射纳络酮（5mg／kg），30min后，各组小鼠腹腔注射新鲜配制的0.6%冰醋酸溶液0.2mL／只，观察小鼠产生“扭体”反应，表现为腹部凹陷，躯干后腿伸直，臀部高起，并记录15min内扭体次数，数据做统计学处理，并按以下公式计算镇痛率。镇痛率%＝[（模型对照组扭体次数-给药组扭体次数）／模型对照组扭体次数]×100%。
1.2.4.2 热板法实验
1.2.4.2.1 动物筛选 取昆明种小鼠110只，雌性，体质量（20±2）g，于（55.0±0.5）℃YLS-6B智能热板仪的金属板上，测定小鼠自放在金属板上至出现舔后足所需时间（s）作为该鼠的基础痛阈值，舔足时间小于5s或大于30s或跳跃者视为不合格，排除参加实验。
1.2.4.2.2 正式实验 将筛选合格的90只小鼠按基础痛阈值随机、均分为6组，每组15只，即空白对照组（蒸馏水）、阴性对照组（纳洛酮5mg／kg）、阳性对照组（盐酸哌替啶40mg／kg）、飞机草高、中、低剂量组（40、20、10g／kg），间隔30 min测其正常痛阈值2次，取2次正常痛阈值的平均值为其正常痛阈值，然后给予相应药物，1次／天，给药容量为20mL／kg，连续给药3d，空白对照组和阴性对照组给予等量蒸馏水，末次给药前12h禁食不禁水，于末次给药后30min，除空白对照组小鼠皮下注射生理盐水外，其余各组小鼠皮下注射纳络酮（5mg／kg），30min后，将小鼠放在（55.0±0.5）℃ YLS-6B智能热板仪的恒温金属板上，分别记录其第1次舔后足的时间，作为其痛阈值，数据做统计学处理。
1.3 对福尔马林致炎性疼痛小鼠血清和脑组织中NO和PGE2含量的影响
1.3.1 测试样品制备 取昆明种小鼠60只，雄性，体质量（20±2）g，随机分为6组，即空白对照组（蒸馏水）、模型对照组（蒸馏水）、阳性对照组（阿司匹林200mg／kg）、飞机草高、中、低剂量组（40、20、10g／kg），每组10只，给予相应药物，给药容量20mL／kg，1次／天，连续给药3d，空白对照组和模型对照组给予等量的蒸馏水。末次给药前小鼠禁食不禁水12h，末次给药后1h，于小鼠左后肢足跖部皮下注射1%的福尔马林溶液10μL／只30min后，快速摘小鼠眼球取血，分离血清备测；同时处死小鼠，取全脑组织称质量，加入适量生理盐水制成10%脑组织匀浆液，3 000r／min离心10min，取上清液备测。将血清和脑组织匀浆上清液置-20℃冰箱中保存，待测NO和PGE2含量。
1.3.2 小鼠脑组织和血清中NO、PGE2含量测定 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），严格按照试剂盒说明书进行测定。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值，最终浓度＝实际测定浓度×稀释倍数。
1.4 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行数据理，计量资料以±s表示，两组间均数差异用t检验（方差不齐时采用t检验校正公式），以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 脊髓化小鼠甩尾实验 50℃温水浴条件下，模型对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与飞机草高剂量组和阳性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1 飞机草对小鼠脊髓化甩尾痛阈值的影响（±s）
表1 飞机草对小鼠脊髓化甩尾痛阈值的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，与模型对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg） 药后痛阈值（s）空白对照组15 - 18.52±8.53模型对照组 15 - 20.02±12.57阳性对照组 15 0.2 34.56±16.42a飞机草高剂量组 15 40 31.52±14.14a飞机草中剂量组 15 20 26.53±12.44飞机草低剂量组15 10 28.27±15.47
2.2 福尔马林致炎性疼痛实验 在0～10min（早期相）内，飞机草高、中剂量组，阳性对照组Ⅰ能明显提高小鼠痛阈，与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；在10～30min（晚期相）内，飞机草高、中剂量组，阳性对照组Ⅰ、Ⅱ均能明显提高小鼠痛阈，与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。
2.3 纳洛酮阻断的冰醋酸扭体实验 与模型对照组比较，纳洛酮对冰醋酸所致扭体反应无明显影响（P＞0.05）；在纳洛酮预处理情况下，盐酸哌替啶镇痛作用被阻断，对冰醋酸所致扭体反应次数无明显减少（P＞0.05）；飞机草高、中剂量仍能显着减少冰醋酸所致扭体反应次数，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。
2.4 纳洛酮阻断的热板实验 在约55℃热板条件下，与空白对照组比较，纳洛酮对热刺激所致疼痛无明显影响（P＞0.05）；在纳洛酮预处理情况下，盐酸哌替啶镇痛作用被阻断，对热刺激所致疼痛无明显影响（P＞0.05）；飞机草高、中剂量仍能显着延长小鼠舔后足的时间（P＜0.05），见表4。
表2 飞机草对由福尔马林致炎小鼠痛阈的影响（±s）
表2 飞机草对由福尔马林致炎小鼠痛阈的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，b：P＜0.01，与模型对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg）疼痛反应积分（分）30min模型对照组0～10min 10～10 - 1.47±0.36 3.74±0.43阳性对照组Ⅰ 10 0.04 0.75±0.43b 3.22±0.33a阳性对照组Ⅱ 10 0.2 1.38±0.46 3.18±0.64a飞机草高剂量组 10 40 0.83±0.42b 3.07±0.73a飞机草中剂量组 10 20 1.02±0.41a3.23±0.58a飞机草低剂量组10 10 1.23±0.513 3.35±0.43
表3 飞机草对纳洛酮阻断的小鼠冰醋酸扭体反应次数的影响（±s）
表3 飞机草对纳洛酮阻断的小鼠冰醋酸扭体反应次数的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，与模型对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg）扭体次数（次／15min）镇痛率（%）模型对照组15 - 46.00±27.51 -阳性对照组 15 0.04 43.00±21.98 6.52阴性对照组 15 0.005 42.00±24.75 8.70飞机草高剂量组 15 40 26.00±18.31a43.48飞机草中剂量组 15 20 28.00±17.20a39.13飞机草低剂量组15 10 41.00±20.34 10.87
表4 飞机草对纳洛酮阻断的小鼠热板痛阈值的影响（±s）
表4 飞机草对纳洛酮阻断的小鼠热板痛阈值的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，与空白对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg） 药后痛阈值（s）空白对照组15 - 12.34±8.02阳性对照组 15 0.04 13.84±12.14阴性对照组 15 0.005 13.12±6.01飞机草高剂量组 15 40 23.88±16.69a飞机草中剂量组 15 20 21.52±12.51a飞机草低剂量组15 10 14.21±10.36
表5 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中NO含量的影响（±s）
表5 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中NO含量的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，b：P＜0.01，与模型对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg）脑组织NO含量（μmol／g）血清NO含量（μmol／L）空白对照组 10 - 3.08±1.15b 0.78±0.24b 10 10 8.18±2.93 2.33±1.19模型对照组 10 - 9.53±6.19 2.95±1.63阳性对照组 10 0.2 4.85±2.42a 1.67±0.91a飞机草高剂量组 10 40 4.39±1.69a 1.51±0.75a飞机草中剂量组 10 20 4.73±2.95a 1.71±0.65a飞机草低剂量组
2.5 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中NO含量测定 与空白对照组比较，模型对照组小鼠脑组织和血清中的NO含量显着增加（P＜0.01）；与模型对照组比较，阳性对照组、飞机草高、中剂量组小鼠脑组织和血清中的NO含量明显降低（P＜0.05），见表5。
2.6 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中PGE2含量测定 与空白对照组比较，模型对照组小鼠脑组织和血清中的PGE2含量显着增加（P＜0.01）；与模型对照组比较，阳性对照组、飞机草高、中剂量组小鼠脑组织和血清中的PGE2含量明显降低（P＜0.05），见表6。
表6 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中PGE2含量的影响（±s）
表6 对福尔马林致炎疼痛小鼠脑组织和血清中PGE2含量的影响（±s）
-：无数据；a：P＜0.05，b：P＜0.01，与模型对照组比较。
组别 n 剂量（g／kg）脑组织PGE2含量（pg／L）血清PGE2含量（pg／L）空白对照组 10 - 34.07±11.05b 36.70±13.47b模型对照组 10 - 265.18±156.10 270.10±158.99阳性对照组 10 0.2 142.66±68.07a150.40±71.25a飞机草高剂量组 10 40 139.23±65.84a142.10±73.10a飞机草中剂量组 10 20 141.77±71.77a144.40±95.30a飞机草低剂量组10 10 242.56±91.86 216.50±85.17
3 讨 论
利用脊髓化动物中枢神经系统和外周神经系统分离的特点，观察动物在50℃温水浴中的甩尾反应来反应药物是否存在外周镇痛效果，结果显示飞机草能明显延长小鼠甩尾时间；纳络酮可完全拮抗阿片受体激动药的镇痛作用[7-8]。纳洛酮阻断后，飞机草仍能明显减少冰醋酸性炎症疼痛致扭体反应次数，对热致痛也有明显提高药后痛阈值，延长小鼠舔后足的时间作用，以上结果均表明飞机草有明显的外周镇痛作用。
福尔马林致炎性疼痛模型是目前公认的一种较好的研究药物镇痛作用的模型[9]，其致痛分为2个时相，Ⅰ相（早期相）是由于福尔马林直接刺激外周神经末梢所致，Ⅱ 相（晚期相）则主要为炎症介质的产生、释放引起[10-11]。麻醉性镇痛药如盐酸哌替啶等对2个时相疼痛均有抑制，而外周镇痛药如阿司匹林等药只能抑制Ⅱ相疼痛。实验结果显示飞机草高、中剂量对Ⅰ、Ⅱ相疼痛均有明显抑制作用，表明飞机草除了外周镇痛作用外，还具有一定的中枢镇痛作用。
目前认为疼痛与PGE2和NO有密切关系。PGE2的外周致痛作用早已明确，近年来越来越多的研究资料表明中枢产生的PGE2在痛觉传递过程中也起重要作用[12-13]。NO是一种信息传递物质和神经递质，以不同水平在外周和中枢中参与痛觉的调节。同时，NO可促进疼痛传入和致痛介质的释放，并促进脊髓痛觉过敏形成和脑内痛觉信息的加工[14-15]。本研究结果表明，飞机草对血清和脑组织中的NO和PGE2水平均有显着的降低作用。
综上所述，飞机草的镇痛部位既可能在中枢，又可能在外周，且其镇痛作用与降低中枢和外周NO、PGE2水平有关。
[1] 朱华，韦松基.壮药药材学[M].南宁：广西民族出版社，2006：276.
[2] 秦树森，曾春晖，陈益清，等.飞机草镇痛作用研究[J].广西中医药，2013，36（4）：64-66.
[3] 赵学军，奇锦峰，李卫民，等.芎附正天软胶囊治疗偏头痛的镇痛药效学研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（5）：346-348.
[4] 叶勇，姚广涛，阮叶萍，等.江浙蝮蛇毒镇痛组分的中枢作用机制研究[J].中国药学杂志，2005，40（2）：25-28.
[5] 左仁云.罗非西布的药理及临床[J].中国新药杂志，2000，9（9）：601-604.
[6] 胡然，库宝善，朱素君，等.贯叶连翘提取物和盐酸赖氨酸复方的镇痛作用研究[J].中国临床康复，2003，7（26）：3600-3601.
[7] 王瑞，王姝，睢大筼.纳洛酮心血管保护作用研究进展[J].武警医学院学报，2011，22（10）：907-908.
[8] Leppert W.The role of opioid receptor antagonists in the treatment of opioid-induced constipation：a review [J].Adv Ther，2010，27（10）：714-730.
[9] Hunskaar S，Fasmer OB，Hole K.Formalin test in mice：a useful technique for evaluating mild analgesic[J].J Neurosci Methods，1985，14（1）：69-76.
[10] 孙波，李兆申.非甾体类抗炎药与胃肠道损伤[J].上海医院药学，2000，11（3）：17-21.
[11] 颜文革，张守芳.非甾体抗炎药机理进展[J].沈阳药科大学学报，2001，18（1）：64-67.
[12] Malmberg AB，Yaksh TL.Cyclooxygenase inhibitor and the spinal release of prostaglandin E2and amino acids evoked by paw formalin injection：a microdialysis study in unanesthetized rats[J].J Neurosci，1995，15（8）：2768-2776.
[13] Malmberg AB，Yaksh TL.The effect of morphine on formalin-evoked behaviour and spinal release of excitatory amino acids and prostaglandin E2using microdialysis in conscious rats[J].Br J Pharmacol，1995，114（5）：1069-1075.
[14] Jain NK，Patil CS，Singh A，et al.Sildenafil-induced peripheral analgesia and activation of the nitric oxide-cyclic GMP pathway[J].Brain Res，2001，909（1／2）：170-178.
[15] Kuroda R，Kawao N，Yoshimura H，et al.Secondary somatosensory cortex stimulation facilitates the anti-nociceptive effect of the NO synthase inhibitor through suppression of spinal nociceptive neurons in the rat[J].Brain Res，2001，903（1／2）：110-116.
