葛晓军，郑丽梅，王永伦，唐彦萍
(遵义医学院：1.第一附属医院检验科；2.第一附属医院中医科；3.生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义 563003)
金钗石斛多糖对髓系白血病细胞WT1基因表达的影响*
葛晓军1，郑丽梅2，王永伦1，唐彦萍3△
(遵义医学院：1.第一附属医院检验科；2.第一附属医院中医科；3.生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义 563003)
目的 探讨金钗石斛多糖对髓系白血病细胞WT1基因表达的影响。方法 用CCK8方法检测金钗石斛多糖在3种白血病细胞中的IC50值；3种细胞各分两组，对照组和处理组，对照组细胞保持正常生长，处理组给予金钗石斛多糖刺激。Hoechst33258染色检测两组细胞凋亡情况，用RT-PCR检测WT1表达水平，Western blot检测WT1、P53和BAX蛋白表达。结果 金钗石斛多糖在3种白血病细胞中具有相近的IC50值，HL-60、WEHI-3、K562细胞的IC50分别为(110.71±6.49)、(104±48.50)、(96.66±5.10)mg/mL，3种细胞的IC50值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；处理组凋亡率高于对照组(P<0.05)；与对照组比较，处理组WT1基因、蛋白表达水平降低(P<0.05)，P53和BAX蛋白表达增高。结论 金钗石斛多糖能明显降低WT1蛋白表达水平，且对白血病细胞有一定杀伤作用。
石斛；多糖；基因，肾母细胞瘤；白血病
肾母细胞瘤(wilms tumor，WT1)基因位于染色体11p13位点，研究者早期认为该基因为Wilms瘤的抑癌基因[1]。然而，随后越来越多的研究提示WT1 基因可能作为调控造血细胞增生和(或)分化基因的转录抑制剂或激活剂，并且在白血病的发生、发展及预后中起重要的作用[2-4]。金钗石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物，是中国传统名贵中药，金钗石斛有益胃生津、延年益寿、抗衰老、抗肿瘤和增强机体免疫力等作用[5]。它被制成石斛夜光丸等成品药。金钗石斛的药用成分主要是石斛碱及多糖类物质[6]。多糖类成分是石斛中具有免疫增强作用的活性成分[7]。本研究旨在探讨髓系白血病细胞在金钗石斛多糖干预下，采用RT-PCR和Western blot技术检测WT1基因表达水平，确定金钗石斛多糖在髓系白血病中的药用价值。
1 材料与方法
1.1 材料 急性早幼粒细胞白血病HL-60，慢性骨髓性白血病细胞系K-562，骨髓单核细胞白血病WEHI-3由华西科技园信号转导实验室馈赠。均用RPMI-1640含10% FBS培养；Hoechst33258检测细胞凋亡试剂盒、RNA提取试剂、逆转录试剂盒、SYBR-greenⅠ试剂盒购自TIGEN公司；WT、p53、BAX和内参GAPDH单克隆抗体购自Abcam公司。采用水提醇沉的方法提取金钗石斛多糖[8]。
1.2 方法
1.2.1 CCK-8检测金钗石斛多糖对3种细胞的IC50分别收集对数生长期的细胞HL-60，K-562，WEHI-3重悬于10%小牛血清的PRIM-1640完全培养基，计数板计数，置于96孔培养板，每孔4 000个/100 μL，轻摇混匀，37 ℃ 5%CO2孵箱培养24 h；次日将金钗石斛多糖按10、30、60、100、200、300 mg/L加入各孔内，每种细胞每种浓度各设置3个复孔，连续培养48 h；48 h后取出96孔板，每孔按10∶1的比例加入培养基与CCK-8的混合物，同时在无细胞的孔内加入该混合物作为空白对照，在无菌孵箱中避光培养3 h；用Micro-ELISA仪测定每个孔的吸光度值，设定检测波长为490 nm/630 nm；以药物浓度为横坐标，3个孔的平均相对吸光度值为纵坐标，观察各细胞系的IC50。以上实验重复3次。
1.2.2 Hoechst33258检测细胞凋亡 取对数生长期的3种细胞，调整浓度为1×104个/ mL，以每孔0.5 mL接种于24孔板，RPMI-1640含10% FBS培养24 h后，分为处理组和对照组，处理组加入100 mg/kg金钗石斛多糖，对照组不加药物处理。24 h后，去除培养液，每孔加入0.5 mL固定液，固定10 min；去除固定液，用PBS清洗2遍，每次清洗3 min，去除液体；加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min，吸尽液体；滴1滴抗荧光猝灭剂于24孔板内，荧光显微镜观察。显微镜下每组细胞记数5个视野，每个视野记数100个细胞，取平均值，计算凋亡率。以上实验重复3次。
1.2.3 RT-PCR检测3组细胞WT1基因表达水平 根据试剂盒说明书，用Trizol试剂盒提取对照组和处理组总RNA，经过逆转录为cDNA，保存于-80 ℃冰箱或是继续后续实验。RT-PCR检测处理组和对照组WT1基因表达水平。WT1基因序列参照 Tamaki等[9]报道方法，WT1上游引物序列：5′-CCA CAG CAC AGG GTA CGA GAG-3′，下游引物序列：5′-TCT CAG ATG CCG ACC GAT CAA-3′，扩增片段长度152 bp；内参基因β-actin上游引物：5′-CGC TGC TTG CCA ATA GTA AT-3′，下游引物：5′-CCA CAG GCA TTG TGA TGG-3′。RT-PCR反应条件为：2×SYBR-green mix 20 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，用超纯水扩容至40 μL。条件为：94 ℃预变性2 min；93 ℃变性45 s；60 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s；共40个循环,每组DNA内参基因、目的基因各3管，同批次扩增，反应结束后由计算机自动计算定量结果。以上实验重复3次。
1.2.4 Western blot检测WT1蛋白表达情况 取对数生长期细胞，按照上述分组，药物作用24 h后提取蛋白，根据BCA蛋白测试试剂盒说明书进行蛋白定量。蛋白样品与loading buffer按1∶1混合后于100 ℃中煮沸5 min；取20～40 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V；湿法将蛋白转到PVDF膜上，恒流260 mA，120 min；5%脱脂奶粉于室温封闭2 h；PBS稀释一抗，4 ℃缓慢振荡孵育过夜，PBS洗3次，每次10 min；TBST稀释二抗，于室温孵育2 h，TBST洗3次，每次5～10 min，避光；Odyssey红外荧光检测仪扫描。以上实验重复3次。
2 结 果
2.1 3种细胞系IC50检测结果比较CCK-8测得3种细胞在不同药物浓度下的吸光度值，绘制药物剂量效应曲线，根据曲线估计各细胞系IC50范围，再以该范围内的药物浓度处理细胞，最终测得HL-60细胞的IC50为(110.71±6.49)mg/mL，WEHI-3细胞的IC50为(104±48.50)mg/mL，K562细胞的IC50为(96.66±5.10)mg/mL，3种细胞的IC50值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。
图1 3种细胞的金钗石斛多糖IC50值
图2 Hoechst33258染色检测细胞凋亡(×200)
2.2 细胞凋亡检测结果 由于3种白血病细胞对金钗石斛多糖的IC50值接近，约为100mg/mL，故在Hoechst33258凋亡实验检测中，处理组均给予100mg/mL金钗石斛多糖处理，对照组不加药物。经过Hoechst染色检测细胞凋亡，染色结束后，荧光显微镜下观察凋亡细胞，每组细胞观察5个视野，每个视野记数100个细胞，3种白血病细胞处理组凋亡率均高于对照组(P<0.05)，见表1、图2。
表1 两组细胞凋亡检测结果比较(%)
a：P<0.05，与对照组比较。
2.3 3种细胞系在金钗石斛多糖作用下WT1基因及蛋白表达比较 金钗石斛多糖(100mg/mL)刺激后，3种白血病细胞处理组WT1基因表达水平均低于对照组(图3)；3种白血病细胞处理组WT1蛋白表达降低，凋亡相关蛋白P53和BAX蛋白表达增加，见图4。
a：P<0.05，与对照组比较。
图3 两组细胞WT1基因表达比较
-：对照组；+：处理组。
图4 两组细胞WT1、P53 和BAX蛋白表达比较
3 讨 论
近几十年来，WT1基因一直受到研究者和临床医生的关注，诸多的研究结果表明，WT1基因与白血病的发生、发展、预后和耐药方面都有相关性[10]。金钗石斛为兰科多年生草本植物，是中国的传统名贵中药材，具有极高的药用价值。金钗石斛的有效成分主要是石斛多糖和石斛碱，在本研究中，主要探讨石斛多糖的药理活性，多糖是生物有机体的主要成分之一，维持着生命的主要功能和活动，目前的研究指出，多糖可以增强生物体的免疫能力，且具有抗炎、抗肿瘤的作用[11]。本研究所用的金钗石斛产于贵州省赤水市，是国家质量监督检验检疫总局批准的地理标志产品，并认定金钗石斛为赤水道地药材。在前期的研究中，本课题组探讨了金钗石斛多糖对炎症因子脂多糖的作用，最终证明金钗石斛多糖具有抗炎的作用[12]；随后，在糖尿病研究中，也发现金钗石斛多糖可以改善糖尿病患者的生存状态和缓解患者的症状[13]。有研究报道，大黄多糖、香菇多糖等可以通过调节肿瘤细胞免疫活性的机制来达到抑制肿瘤生长的目的[14]，因此，认为金钗石斛多糖对肿瘤细胞应该也具有较好的抑制作用。在本研究中，主要探讨了金钗石斛多糖对髓性白血病细胞的影响，首先通过CCK8实验，确定金钗石斛在3种白血病细胞中的IC50值；随后用100mg/L的金钗石斛多糖刺激白血病细胞，经过Hoechst33258染色观察凋亡情况，可以明显看出，金钗石斛多糖刺激细胞后，细胞凋亡增加；通过荧光定量PCR和蛋白表达分析，加入金钗石斛多糖后，白血病细胞WT1蛋白表达减低。细胞凋亡和蛋白分析结果均表明，金钗石斛多糖对白血病细胞具有一定杀伤作用。很多研究都是通过RT-PCR或是荧光定量PCR来检测WT1基因的表达情况[15-16]，严格来讲，这两种实验方法只能反映WT1基因的RNA的表达情况，不能客观的反映实际的WT1蛋白表达水平。本实验采用RT-PCR和Westernblot两种技术来检测WT1蛋白的表达水平，结果显示，在金钗石斛多糖刺激后，3种白血病细胞的WT1表达减低，且凋亡相关的蛋白P53和BAX表达都是增高的，这也支持了Hoechst33258检测的凋亡结果。有研究表明，WT1基因可以通过上调bcl-2的表达水平，来达到抗凋亡的目的[17]，在本研究中未见该蛋白表达。以往的报道中，WT1作为一种转录调控因子，不仅可以上调很多生长因子的表达水平，如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和胰岛素生长因子(IGF)等，还可以上调这些生长因子的受体表达，从而导致细胞增殖速度增加[18]。本研究结果显示，金钗石斛多糖可以通过抑制WT1的表达水平使白血病细胞凋亡增多，而WT1是否通过这些生长因子或是其受体来导致肿瘤的恶性增生，金钗石斛是否通过抑制WT1基因的表达水平进而导致肿瘤相关的生长信号表达下调，以及金钗石斛多糖对常规的化疗药物是否具有增敏作用，都需要进一步研究证实。
[1]HohensteinP,HastieND.ThemanyfacetsoftheWilms′tumourgene,WT1[J].HumMolGenetics,2006,15(2):R196-201.
[2]KeilholzU,LetschA,BusseA,etal.Aclinicalandimmunologicphase2trialofWilmstumorgeneproduct1 (WT1)peptidevaccinationinpatientswithAMLandMDS[J].Blood,2009,113(26):6541-6548.
[3]TsuboiA,OkaY,NakajimaH,etal.WilmstumorgeneWT1peptide-basedimmunotherapyinducedaminimalresponseinapatientwithadvancedtherapy-resistantmultiplemyeloma[J].IntJHematol,2007,86(5):414-417.
[4]PaschkaP,MarcucciG,RuppertAS,etal.Wilms′tumor1genemutationsindependentlypredictpooroutcomeinadultswithcytogeneticallynormalacutemyeloidleukemia:acancerandleukemiagroupBstudy[J].JClinOncol,2008,26(28):4595-4602.
[5]管志斌,李再林.珍稀名贵中药-金钗石斛[J].中国野生植物资源,2002,21(4):36-37.
[6]王琳,叶庆生,刘伟.金钗石斛研究概况[J].亚热带植物科学,2004,33(2):73-76.
[7]杨艳,徐应淑.川、黔地区金钗石斛多糖的含量测定[J].中国药房,2010,21(27):2552-2554.
[8]李小琼,葛晓军,郑斯卓,等.金钗石斛多糖的提取及部分理化性质分析[J].江苏大学学报:医学版,2008,18(5):446-447.
[9]TamakiH,OgawaH,OhyashikiK,etal.TheWilms′tumorgeneWT1isagoodmarkerfordiagnosisofdiseaseprogressionofmyelodysplasticsyndromes[J].Leukemia,1999,13(3):393-399.
[10]OgawaH,TamakiH,IkegameK,etal.TheusefulnessofmonitoringWT1genetranscriptsforthepredictionandmanagementofrelapsefollowingallogeneicstemcelltransplantationinacutetypeleukemia[J].Blood,2003,101(5):1698-1704.
[11]郑晓珂,曹新伟,冯卫生,等.金钗石斛的研究进展[J].中国新药杂志,2005,14(7):826-829.
[12]李小琼,金徽,葛晓军,等.金钗石斛多糖对脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α·NO的影响[J].安徽农业科学,2009,37(28):13634-13635.
[13]陶凤,金徽,杨贵忠,等.金钗石斛水提物对糖尿病大鼠肾组织非酶糖基化及氧化的影响[J].山东大学学报:医学版,2012,50(10):50-55.
[14]付书婕,王乃平,黄仁彬.植物多糖免疫调节作用的研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(1):99-101.
[15]WeisserM,KernW,RauhutS,etal.PrognosticimpactofRT-PCR-basedquantificationofWT1geneexpressionduringMRDmonitoringofacutemyeloidleukemia[J].Leukemia,2005,19(8):1416-1423.
[16]TamakiH,MishimaM,KawakamiM,etal.Monitoringminimalresidualdiseaseinleukemiausingreal-timequantitativepolymerasechainreactionforWilmstumorgene(WT1) [J].IntJHematol,2003,78(4):349-356.
[17]赵谢兰,雷瑚仪,高欣,等.急性髓性白血病骨髓细胞NF-κB活性及其与WT1和Bcl-2表达的关系[J].中国医师杂志,2006,8(7):880-882.
[18]Chabbert-BuffetN,BouchardP.Thenormalhumanmenstrualcycle[J].RevEndocrMetabDisord,2002,3(3):173-183.
Study on effect of dendrobium nobile polysaccharides on expression of WT1 gene in myeloid leukemia cells*
GeXiaojun1,ZhengLimei2,WangYonglun1,TangYanping3△
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospital;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,FirstAffiliatedHospital;3.DepartmentofMolecularBiologyandBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)
Objective To explore the effect of dendrobium nobile polysaccharides on the expression of the WT 1 gene in myeloid leukemia cells.Methods The CCK8 assay was used to detect the half maximal inhibitory concentration(IC50) of dendrobium nobile polysaccharides in 3 kinds of leukemia cells;the each kind of leukemia cells were divided into the treatment group and the control group.The cells in the control group maintained the normal growth,while which in the treatment group were given the dendrobium nobile polysaccharides stimulation.The Hoechst33258 staining was used to detect the apoptosis situation of the cells in the two groups.The WT l gene expression level was detected by the real-time PCR and the protein expression levels of WT1,53 and BAX were detect the Western blot.Results Dendrobium nobile polysaccharides had the similar IC50values in 3 kinds of myeloid leukemia cells,which were (110.71±6.49),(104±48.50),(96.66±5.10)mg/mL respectively,the difference among them had no statistical significance (P>0.05);the apoptosis rate of the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05);the expression levels of WT1 gene and protein in the treatment group were decreased compared with the control group(P<0.05),while the expression of P53 and BAX protein was increased.Conclusion Dendrobium nobile polysaccharides can obviously decrease the expression level of WT1 protein,and has a certain killing effect on myeloid leukemia cells.
dendrobium nobile;polysaccharide;gene,Wilms tumor;leukemia
� 着·
10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.003
国家自然科学基金资助项目(30960509/C190704)。 作者简介：葛晓军(1981-)，主管技师，博士研究生，主要从事白血病发病原因和耐药机制研究。△
，Tel：13312307061；E-mail：bifeng199421@126.com。
R733.71
A
1671-8348(2015)10-1305-03
2014-10-18
2014-12-15)
