王媛媛，苏攀柯，黄爱龙，胡接力△
(1.河南科技大学第一附属医院检验科，河南洛阳 471000；2.重庆医科大学附属第二医院
·技术与方法·
TALE-TFs构建方法的建立及优化
王媛媛1，苏攀柯1，黄爱龙2，胡接力2△
(1.河南科技大学第一附属医院检验科，河南洛阳 471000；2.重庆医科大学附属第二医院
教育部感染性疾病分子生物学重点实验室，重庆 400016)
目的 在传统方案的基础上建立一种经济有效且易于操作的类转录激活效应子转录因子(TALE-TFs)的构建和功能检测方案。方法采用基于PCR的Golden gate克隆法分别尝试构建类转录激活效应物(TALEs)的六聚体、五聚体、四聚体和三聚体，比较构建结果，选择最优效果方案进行TALE-TFs的构建。采用片段置换反应(FSR)构建了含有TALE-TFs结合片段的RFP质粒pminCMV，并与TALE-TFs进行共转染，观察红色荧光验证TALE-TFs的转录活性。结果TALEs中所含的串联重复模块越少，获得的构建产物越多。共转染时，TALE-TFs使得pminCMV成功启动表达。结论该研究为不同条件下实验方案的选择提供了依据，并利用含有TALE-TF结合片段和红色荧光的质粒建立了快捷直观的转录活性验证方法。
类转录激活效应物;质粒构建;转录;转染
类转录激活效应物(TALEs)蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它类似于真核生物的转录因子，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因的转录，促进细菌定植。TALEs蛋白中部包含一段由串联重复单体构成的DNA特异识别和结合区域，其中每个单体含有大约34个氨基酸。而TALEs的重复部分是由数个重复单体加约含20个氨基酸残基的0.5个重复单位构成[1]。天然形成的TALEs具有大约1.5～33.5个数量不等的单体，虽然每个单体在序列上是高度保守的，但是他们的第12 和13位点的氨基酸却有所不同，这两个位点被命名为重复可变双残基(RVD)。每个RVD中有一个简单密码来指定识别一个特定的碱基，从而决定了TALEs核苷酸结合的特异性。如NI(Asn/Ile)对应A、NG(Asn/Gly)对应T、HD(His/Asp)对应C、NN(Asn/Asn)对应G/A[2-3]。人工定制的TALEs可以运用到基因组工程的多个方面，包含起转录修饰作用的TALE-TFs和基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)等[4-7]。
人工定制TALEs技术作为一个全新而又有效的基因组工程策略将会成为大多数实验室所必备的技术之一，因此本课题组针对TALE-TFs的构建进行尝试，希望建立一套适合本实验室使用，而制备手段又更为优化快捷和直观的实验方案。一般实验室构建方案多采用以初次Golden Gate反应生成TALEs六聚体为基础，经过2次Golden Gate反应最终形成十八聚体。本实验对初次Golden Gate反应形成TALEs三聚体、四聚体、五聚体和六聚体分别进行了构建尝试，在兼顾获取难度和识别的目的基因长短的基础上选择了五聚体进行了下一步构建。在功能测定方案上改变传统的质粒构建和定量RT-PCR相结合的方案，采用联合片段置换反应(FSR)[8](不需要进行酶切连接的克隆技术，由本课题组在前期建立的基因克隆技术)构建了带有目的基因片段和红色荧光报告基因的质粒，通过共转染的方式来直接观察TALE-TFs的转录效率。这为本课题组下一步进行体内基因转录调节奠定了基础，并为其他构建者提供经验和新的方案参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 合成引物(生工生物工程上海有限公司)，TALEs单体模板(Addgene提供)，Herculase Ⅱ fusion polymerase(购自Agilent Technologies)，BsmBI、BsaI-HF、AfeI(购自NEW England Biolabs)，T7 DNA ligase、Tag-B polymerase(购自Enzymatics)，DL2000 DNA Marker(购自宝生物大连有限公司)，PlasmiSafe ATP-dependent DNase (购自Epicentre),转染试剂LipofectamineTM-2000 (购自Invitrogen)，质粒提取试剂、质粒载体pEGFP-N1、腺病毒Ad-RFP(购自Promega)，转染细胞293HEK、DH5a感受态(重庆医科大学教育部感染性疾病分子生物学重点实验室)。
1.2 实验方法
1.2.1 引物制备 根据实验需要本课题组制备了一系列的引物(表1)。
1.2.2 以TALEs单体质粒为模板进行扩增 分别选择TALEs单体质粒NI、NG、HD、NN为模板，根据其所在串联结构的位置，选择相应的引物，进行PCR扩增。引物选择方案见表2。PCR反应采用100 μL反应体系：单体模板质粒(5 μg/μL)1 μL，dNTP(100 μmol/L)1 μL，Herculase Ⅱ PCR buffer(5 ×)20 μL，20 μmol/L primer mix 2 μL，Herculase Ⅱ fusion polymerase 1 μL，Distilled water补足到100 μL。PCR反应程序按照：95 ℃ 预变性2 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，进行32个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR产物进行电泳和胶回收，执行产物纯化后备用。
1.2.3 利用Golden Gate反应制备环形多聚体 采用配对引物(表2)分别进行环形六聚体、五聚体、四聚体、三聚体的组装，多聚体构建方案，以五聚体为例见图1A。比较结果，决定最后要选择的多聚体构建方案，对照靶识别的序列，构建识别3个连续序列的多聚体，每个所含重复单体数目相同。均采用10 μL反应体系：BsmI(10 U/μL)0.75 μL，Tango buffer(10×)1 μL，DTT(10 mM)1 μL，T7 Ligase(3 000 U/μL)0.25 μL，ATP(10 mM)1 μL，6个单体按照选择个数各1 μL，不足10 μL时用Distilled water补足。Golden Gate反应结束后，采用PlasmiSafe ATP-dependent DNase消化降解非环形结构后纯化产物。降解方法见产品说明。
表2 TALEs构建的引物选择方案
1～18：TALEs中单体对应所识别碱基在靶识别片段中的位置。
1:Hexmaer1;2:Hexmaer2;3:Hexmaer3;4:Trimer;5:Tetramer;6:Pentamer;7:Pentamer1;8:Pentamer2;9:Pentamer3。
图1 TALEs多聚体的构建
1.2.4 第2次Golden Gate反应形成最后的TALEs结构并转化 用Hex-F和Hex-R为引物对构建的多聚体进行扩增，3个多聚体扩增后的片段结合TALE-TFs的骨架质粒进行第2次Golden Gate反应。反应体系为：骨架质粒(100 ng/μL)1 μL，BsaI-HF(20 U/μL)0.75 μL,NE Buffer 4(10×)1 μL,BSA(10×)1 μL,ATP(10 mM)1 μL,T7 ligase(3 000 U/μL) 0.25 μL,3个纯化的多聚体每个1 μL，Distilled water补足到10 μL。产物纯化后转化。
1.2.5 构建含有TALE-TF识别序列和报告基因的质粒 先从腺病毒Ad-RFP上利用引物F RFP-N1和R RFP-N1对RFP片段进行PCR扩增，将所获得的PCR产物利用FSR克隆技术替换到pEGFP-N1上，获得质粒pRFP。再利用引物Fmin和Rmin对pRFP进行PCR扩增。实验在Fmin及Rmin的引物序列中加入了TTAATTAA的酶切位点，可使其酶切后再自连。此外在Fmin序列中实验还加入了靶识别序列，T ACCAC AAGAA CACTA，识别序列以T开头，后每个RVD对应1个碱基，共识别15个碱基。PCR产物经过酶切连接后将形成1个含有目标靶点序列和RFP报告基因的质粒pminCMV。
1.2.6 采用共转染的方式验证TALE-TF的转录活性 采用转染试剂Lipofectmine2000分别将TALE-TFs载体质粒、pEGFP-N1、和pminCMV 3个质粒和TALE-TFs、pEGFP-N1和pminCMV 3个质粒共转染进入HEK293细胞，利用荧光显微镜对自然光下细胞、绿色荧光和红色荧光进行观察，判断构建质粒TALE-TFs的转录活性，验证其功能。转染方法见试剂说明。
2 结 果
2.1 Golden Gate反应制备环形多聚体 在实验开始之初，作者采用了以六聚体为基础的TALEs构建方案，构建完成后采用引物Hex-F和Hex-R进行扩增，得到六聚体线性结构后电泳(图1B)。如图所示，在750 bp左右的位置存在较弱的六聚体条带，显示其获取效率较低。为了提高多聚体获取效率，作者推测构建更短的多聚体应该更容易。为此，分别构建了三聚体、四聚体和五聚体，同样引物PCR得到电泳条带分别在小于500 bp、500 bp左右和750～500 bp之间(图1C)。这些结果显示，与之前的推测相符，片段越小多聚体的获得效率就越高，所获得的电泳条带的浓度越大。结合靶识别片段的长度及序列，本研究最终选择构建以五聚体为基础的TALEs构建方案。3个五聚体经过2次Golden Gate反应，得到TALEs最终的十五聚体结构。3个五聚体均采用引物Hex-F和Hex-R进行PCR,电泳结果均为750～500 bp(图1D)。
2.2 pminCMV质粒构建结果 第1步，对pRFP进行构建，构建程序见图2A。首先从Ad-RFP中扩增出RFP片段，电泳(图2B)，所得电泳条带在约800 bp处，与预期相符。再采用片段置换反应将该RFP片段克隆到pEGFP-N1中，获得pRFP质粒。转化扩增后提取质粒，利用引物F1.1CMV和R RFP-N1做PCR挑选出阳性克隆(图2B)，结果显示筛选的5个克隆中有4个750～500 bp条带，为阳性克隆，测序结果证明载体构建正确。第2步，采用引物Fmin及Rmin对pRFP质粒进行扩增后，酶切PCR扩增片段，然后自身连接环化，即构建为pminCMV质粒(图2C)。pRFP质粒的PCR产物电泳结果为大小约4 500 bp的片段(图2D左)，生成的pminCMV质粒采用引物F N14710和R SV40进行PCR扩增进行克隆筛选。PCR产物电泳，得到1 200 bp附近条带的为阳性克隆(图2D右)。
2.3 TALE-TF的转录活性验证 将TALE-TFs骨架质粒、pEGFP-N1和pminCMV共转染至HEK293细胞作为阴性对照(图3)。转染后在荧光显微镜下可见大量绿色荧光，红色荧光未见。结果提示，TALE-TFs骨架质粒不能将pminCMV激活使其发出红色荧光。将目标TALE-TFs、pEGFP-N1和pminCMV共转染至HEK293细胞后发现，红色荧光易明显可见(图3)。由此可见，作者构建的TALE-TFs质粒具有转录活性，可使含有目的识别片段的pminCMV成功表达出红色荧光。
图3 TALEs-TF在HEK293细胞中的活性
3 讨 论
在TALEs与DNA的特异性识别的分子密码被破译之后，人们便开始试图将其作为特定基因位点的靶向修饰工具。为了确保TALEs识别的特异性，它所识别的靶基因片段应至少大于10 bp,TALEs结构中应至少含有9.5个重复单元。所以说，TALEs结构中重复序列单元的构建，对于这一靶向修饰技术的建立具有重大意义，而这一环节又恰恰成为了这一技术的难点。因而，从TALEs技术发展至今的3、4年时间里，国外出现了大量关于此项技术的研发和改进的报道。
目前人工构建TALEs技术主要包含有较为昂贵的全序列人工合成[9]，Golden Gate克隆法[4,10]，连续克隆组装法[11-12]、利用基因固相合成的高通量技术[13]和长粘末端的LIC(ligation-independent clonging)[14]组装方法等。其中最常用的为Golden Gate克隆法，它是利用了IIS型限制性核酸内切酶[4,7,15-18]识别位点与切割位点分离的特点，通过相同的IIS型限制性核酸内切酶设计不同黏性末端的方式，实现了一次性酶切连接反应之后片段按照指定次序进行连接，构建出本研究所需要的碱基识别顺序。本实验就是在以基于PCR的Golden Gate克隆法为基础，对这一方法进行尝试和适当改进，建立一套适合于本课题需要和尽可能方便简洁的具体实验方案。
在该实验进行的初始阶段，作者选择常用的以首次Golden Gate反应构建TALEs六聚体的实验方案。六聚体纯化电泳后发现电泳条带很弱，重回收效果不佳(图1B)。于是作者对五聚体、四聚体、三聚体分别进行了构建尝试后发现形成的多聚体结构越小它的获得效率越高(图1C)。综合考虑DNA识别序列的长度，本研究最终选择了构建五聚体。鉴定TALE-TFs的转录效率是考察本实验成功与否的关键。据研究报道，TALE-TFs的转录效率的检测方案常采用将TALE-TFs质粒、报告基因质粒和含有目的识别片段的质粒共转染进细胞，在报告基因荧光显微镜下确认转染效率的前提下，对细胞做定量RT-PCR，验证TALE-TFs的转录活性。此方案结果虽然真实可靠，但是方法较为繁琐，包含转染、质粒构建和RT-PCR，且RT-PCR的结果受质粒转染效率、mRNA的提取效果，DNA污染等诸多因素影响，于是本研究采用将目的基因和报告基因合二为一的质粒构建方案，并采用了课题组前期构建的FSR克隆技术，使得质粒构建快速高效。所获得的pminCMV转录效率验证质粒在结果验证方面表现更为直观，操作更为简洁。
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Establishment and optimization for TALE-TFs construction*
WangYuanyuan1,SuPanke1,HuangAilong2,HuJieli2△
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003China; 2.KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016China)
Objective To optimize the method of transcription activator-like effector transcription factors (TALE-TFs) construction,some improvement and adaption were made based on the traditional methods.Methods We first constructed the basic tandem fragments with different length,including trimer,tetramer,pentamer and hexamer by Golden Gate cloning technique and PCR,then the procedure with the highest efficacy was chosen to construct our TALE-TFs.To determine the function of the TALE-TFs,the plasmid pminCMV with the specific binding sequence of TALE-TFs was constructed by fragment substitution reaction (FSR).The transcription activating function of TALE-TFs was confirmed by the intensity of red fluorescence,after TALE-TFs,pEGFP-N1 and pminCMV plasmid were co-transfected into 293HEK cells.Results An optimized method for TALE-TFs construction and functional assay was established.Conclusion This method can potentially be wildly used in fields that the expression of some constitutively expressed genes needs to be modified.
transcription activator-like effectors; plasmid construction;transcription; transfect
:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.023
国家自然科学基金资助项目(81000732)。
王媛媛(1982-)，硕士，主管检验师，主要从事生物化学检验方面的研究。
△通讯作者，E-mail:hujieli1977@gmail.com。
R34
A
1671-8348(2015)15-2079-05
2014-11-08
2015-02-16)
